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| 标准编号 | GB 15193.23-2014 (GB15193.23-2014) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞染色体畸变试验 | | 英文名称 | National Food Safety Standard -- In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 67.020 | | 字数估计 | 8,819 | | 发布日期 | 12/1/2014 | | 实施日期 | 5/1/2015 | | 标准依据 | 国家卫生计生委公告2014年第19号 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 | | 范围 | 本标准规定了体外哺乳类细胞染色体崎变试验的基本试验方法和技术要求。本标准适用于评价受试物的体外哺乳类细胞染色体崎变。 | GB 15193.23-2014: 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞染色体畸变试验
GB 15193.23-2014 英文名称: National Food Safety Standard -- In Vitro Mammalian Cells Chromosome Aberration Test
书中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
GB １５１９３．２３-２０１４
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞染色体畸变试验
１ 范围
本标准规定了体外哺乳类细胞染色体畸变试验的基本试验方法和技术要求。
本标准适用于评价受试物的体外哺乳类细胞染色体畸变。
２ 术语和定义
２．１ 染色体结构畸变
通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体结构变化。如染色体中间缺失和
断片、染色体互换等。染色体结构畸变可分为染色体型畸变和染色单体型畸变。
２．１．１ 染色体型畸变
染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组等改变。
２．１．２ 染色单体型畸变
染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组等改变。
２．２ 有丝分裂指数
中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值；是反映细胞增殖程度的指标。
２．３ 核内复制
在ＤＮＡ复制的Ｓ期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个Ｓ期的过程。其结果是染色体
有４、８、１６倍的染色单体。
２．４ 裂隙
染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小错误排列。
３ 试验目的和原理
通过检测受试物是否诱发体外培养的哺乳类细胞染色体畸变，评价受试物致突变的可能性。在加
入或不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳类细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋
水仙素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收获细胞、制片、染色、分析染色体畸变。
４ 仪器和试剂
４．１ 仪器
细胞培养箱，倒置显微镜，超净台，离心机。
４．２ 培养液
常用Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培养液，也可选用其他合适培养液。加入
抗菌素，将灭活的胎牛血清或小牛血清按１０％的比例加入培养液。
４．３ 代谢活化系统
４．３．１ S９辅助因子的配制
４．３．１．１ 镁钾溶液
氯化镁１．９ｇ和氯化钾６．１５ｇ加蒸馏水溶解至１００ｍＬ。
磷酸氢二钠４４０ｍＬ，磷酸二氢钠６０ｍＬ，
调ｐＨ至７．４，０．１０３ＭＰａ２０ｍｉｎ灭菌或滤菌。
４．３．１．３ 辅酶-Ⅱ（氧化型）溶液
无菌条件下称取辅酶-Ⅱ，用无菌蒸馏水溶解配制成０．０２５ｍｏｌ／Ｌ溶液，现用现配。
４．３．１．４ 葡萄糖-６-磷酸钠盐溶液
称取葡萄糖-６-磷酸钠盐，用蒸馏水溶解配制成０．０５ｍｏｌ／Ｌ，过滤灭菌。现用现配。
４．３．２ 大鼠肝S９组分的诱导和配制
选健康雄性成年 ＳＤ 或 Ｗｉｓｔａｒ大鼠，体重１５０ｇ～２００ｇ，约５周龄～６周龄。将多氯联苯
溶于玉米油中，浓度为２００ｇ／Ｌ，按５００ｍｇ／ｋｇ体重无菌操作一次腹腔注射，
５ｄ后处死动物，处死前禁食１２ｈ。
也可采用苯巴比妥钠和β-萘黄酮联合诱导的方法进行制备，经口灌胃给予大鼠苯巴比妥钠和β-萘
黄酮，剂量均为８０ｍｇ／ｋｇ体重，连续３ｄ，禁食１６ｈ后断头处死动物。其他操作同多氯联苯诱导。
处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的０．１５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑
制微粒体酶活性的血红蛋白。每克肝（湿重）加０．１ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液３ｍＬ，连同烧杯移入冰浴中，用消毒
剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于４０００ｒ／ｍｉｎ，１ｍｉｎ～２ｍｉｎ）
或组织匀浆器（低于２００００ｒ／ｍｉｎ，１ｍｉｎ）
中制成肝匀浆。以上操作需注意无菌和局部冷环境。
分装于无菌冷冻管中，每管２ｍＬ左右，最好用液氮或干冰速冻后置-８０℃低温保存。
Ｓ９组分制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（Ｌｏｗｒｙ法），每毫升蛋白含量不超过４０ｍｇ为宜，并经
间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于-８０℃低温或冰冻干燥，保存期不超过１年。
４．３．３ １０％S９混合液的制备
一般由Ｓ９组分和辅助因子按１∶９组成１０％的Ｓ９混合液，无菌现用现配。
１０％Ｓ９混合液１０ｍＬ配制如下：
取上述磷酸盐缓冲液６．０ｍＬ、镁钾溶液０．４ｍＬ、葡萄糖-６-磷酸钠盐溶液１．０ｍＬ、辅酶-Ⅱ溶液１．６ｍＬ、
肝Ｓ９组分１．０ｍＬ，混匀，置冰浴中待用。
Ｓ９混合液浓度一般为１％～１０％，实际使用浓度可由各实验室自行决定，但需对其活性进行鉴定，
必须能明显活化阳性对照物，且对细胞无明显毒性。
４．４ 秋水仙素溶液
用ＰＢＳ溶液配制适当浓度的储备液，过滤除菌，在避光冷藏的条件下至少能保存６个月。
５．５９ｇ氯化钾加蒸馏水至１０００ｍＬ。
４．６ 固定液
甲醇∶冰醋酸为３∶１，临用前配制。根据试验条件，可适当调整冰醋酸的浓度，改善染色体分散
度，但不宜过大，导致细胞破裂。
取姬姆萨染料３．８ｇ，置乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至３７５ｍＬ，待完全溶解后，再加
１２５ｍＬ甘油，放入３７℃温箱中保温４８ｈ。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤，２周后使用，作
为姬姆萨染液原液。使用时，取１份姬姆萨染液原液，与９份１／１５ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）混合，
配成其应用液，现配现用。
磷酸盐缓冲液配制方法如下：
５ 试验方法
５．１ 受试物
固体受试物应溶解或悬浮于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度。液体受试物可直接使用或稀释至
适当浓度。受试物应无菌现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性。
５．２ 细胞株
可选用中国仓鼠肺细胞株或卵巢细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞。
试验前检查细胞的核型和染色体数目，检测细胞有无支原体污染。
推荐使用中国仓鼠肺细胞株。
５．３ 剂量
５．３．１ 剂量设置
受试物至少应取３个检测剂量。对有细胞毒性的受试物，其剂量范围应包括从最大毒性至几乎无
毒性（细胞存活率在２０％～１００％的范围内）；通常浓度间隔系数不大于２～槡１０。
５．３．２ 最高剂量的选择
当收获细胞时，最高剂量应能明显减少细胞计数或有丝分裂指数（大于５０％，如毒性过大，应适当
增加接种细胞数）；同时应该考虑受试物对溶解度、ｐＨ和摩尔渗透压浓度的影响；对无细胞毒性或细胞
毒性很小的化合物，最高剂量应达到５μＬ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ或１０ｍｍｏｌ／Ｌ。
对溶解度较低的物质，当达到最大溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限
值以上的一个浓度。在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，
但沉淀不能影响观察。
５．３．３ 细胞毒性的确定
测定细胞毒性可使用指示细胞完整性和生长情况的指标，如相对集落形成率或相对细胞生长率等。
应在Ｓ９系统存在或不存在的条件下测定细胞毒性。
５．３．４ 阳性对照
可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物，应是已知的断裂剂，能引起可检出的、并可重
复的阳性结果。当不存在外源性代谢活化系统时，可使用的阳性对照物有甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、丝裂霉素、
乙基亚硝基脲、硝基喹啉-N-氧化物、环 磷 酰 胺等。
不加Ｓ９的阳性对照常用丝裂霉素Ｃ，其常用浓度为０．２μｇ／ｍＬ～０．８μｇ／ｍＬ。其ｐＨ为６～９的水
溶液在０℃～５℃下避光保存能存放１周。加Ｓ９的阳性对照常用环磷酰胺，其常用浓度为８μｇ／ｍＬ～
１５μｇ／ｍＬ。其水溶液不稳定，应现配现用。
５．３．５ 阴性对照
溶媒应为非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和Ｓ９活性。首选溶媒对照是不
含血清的培养液和水，亦可使用二甲基亚砜，但浓度不应大于０．５％。
５．３．６ 空白对照
如果没有文献资料或历史资料证实所用溶媒无致突变作用时应设空白对照。
５．４ 试验步骤
５．４．１ 细胞培养与染毒
试验需在加入和不加入Ｓ９（Ｓ９的终浓度常为１％～１０％，以细胞毒性试验结果为准）的条件下进
行。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿（瓶）中［以收获细胞时，培养皿（瓶）的细胞未长满为
标准，一般以长到８５％左右为佳；如用ＣＨＬ细胞，可接种１×１０６ 个］，放ＣＯ２ 培养箱内培养。试验时吸
去培养皿（瓶）中的培养液，加入一定浓度的受试物、Ｓ９混合液（不加Ｓ９混合液时，需用培养液补足）以
及一定量不含血清的培养液，置培养箱中处理２ｈ～６ｈ。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用ＰＢＳ
溶液洗细胞３次，加入含１０％胎牛血清的培养液，放回培养箱，于２４ｈ收获细胞。于收获前２ｈ～４ｈ，
加入细胞分裂中期阻断剂（如用秋水仙素，终浓度为０．１μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ）。
当受试物为单一化学物质时，如果在上述加入和不加入Ｓ９混合液的条件下均获得阴性结果，则需
加做长时间处理的试验，即在没有Ｓ９混合液的条件下，使受试物与试验系统的接触时间延长至２４ｈ。
当难以得出明确结论时，应更换试验条件，如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重复试验。
５．４．２ 收获细胞与制片
５．４．２．１ 消化
用０．２５％胰蛋白酶溶液消化细胞，待细胞脱落后，加入含１０％胎牛或小牛血清的培养液终止胰蛋
白酶的作用，混匀，放入离心管以８００ｒ／ｍｉｎ～１０００ｒ／ｍｉｎ的速度离心５ｍｉｎ，弃去上清液。
５．４．２．２ 低渗
加入０．０７５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液２ｍＬ，用滴管将细胞轻轻地混匀，
放入３７℃细胞培养箱中低渗处理３０ｍｉｎ～４０ｍｉｎ。
５．４．２．３ 固定
加入２ｍＬ固定液，混匀后固定５ｍｉｎ以上，以８００ｒ／ｍｉｎ～１０００ｒ／ｍｉｎ
速度离心５ｍｉｎ，弃去上清液。重复一次，弃去上清液。
５．４．２．４ 滴片
加入数滴新鲜固定液，混匀。用混悬液滴片，自然干燥。玻片使用前用冰水浸泡。
５．４．２．５ 染色
５％～１０％姬姆萨染液，１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ。
５．４．３ 阅片
在油镜下阅片，每一剂量组应分析不少于１００个分散良好的中期分裂相，且每个观察细胞的染色体
数在２狀±２范围之内。对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸变类型。
５．５ 观察指标
５．５．１ 染色体数目的改变
５．５．１．１ 非整倍体：亚二倍体或超二倍体。
５．５．１．２ 多倍体：染色体成倍增加。
５．５．１．３ 核内复制：核膜内的特殊形式的多倍化现象。
５．５．２ 染色体结构的改变
５．５．２．１ 断裂：损伤长度大于染色体的宽度。
５．５．２．２ 微小体：较断片小而呈圆形。
５．５．２．３ 有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。
５．５．２．４ 无着丝点环：成环状结构。
５．５．２．５ 单体互换：形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。
５．５．２．６ 双微小体：成对的染色质小体。
５．５．２．７ 裂隙：损伤的长度小于染色单体的宽度。
５．５．２．８ 非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、黏着等。
６ 数据处理和结果评价
６．１ 数据处理
数据按不同剂量列表，指标包括观察细胞数、畸变细胞数、染色体畸变率、各剂量组及对照组不同类
型染色体畸变数与畸变率等。裂隙应单独记录和报告，但一般不计入总的畸变率。各组的染色体畸变
率用χ２ 检验进行统计学处理。
６．２ 结果评价
下列两种情况可判定受试物在本试验系统中为阳性结果：
ａ） 受试物引起染色体结构畸变数的增加具有统计学意义，并与剂量相关；
ｂ） 受试物在任何一个剂量条件下，引起的染色体结构畸变数增加具有统计学意义，并有可重复性。
７ 试验报告
７．１ 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。
７．２ 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。
７．３ 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。
７．４ 试验摘要。
７．５ 受试物：名称、鉴定资料、ＣＡＳ号（如已知）、纯度、与
本试验有关的受试物的物理和化学性质及稳定性等。
７．６ 溶媒：溶媒的选择依据为受试物在溶媒中的溶剂性和稳定性。
７．７ 细胞株：细胞株的来源、名称。
７．８ 试验条件：剂量、代谢活化系统、标准诱变剂、操作步骤等。
７．８．１ 代谢活化系统：制备Ｓ９所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、Ｓ９混合液的配方。
７．８．２ 对照物：阳性对照物的名称、生产厂家、批号和选用浓度。
７．８．３ 培养液：所用培养液的名称、血清类别和使用浓度。
７．８．４ 接种的细胞密度以及所用培养皿（瓶）的规格。
７．８．５ 中期分裂阻断剂：名称、所用浓度、作用时间。
７．８．６ 处理时间：受试物与试验系统的接触时间。
７．８．７ 制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价......
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