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GB 4789.34-2016

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标准详细信息 GB 4789.34-2016; GB4789.34-2016
中文名称: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌检验
英文名称: (Food safety national standard food microbiological examination bifidobacteria test)
行业: 国家标准
中标分类: X09
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): GB 4789.34-2012
标准依据: National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016

GB 4789.34-2016
National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Examination of Bifidobacterium
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB 4789.34-2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定》。
本标准与GB 4789.34-2012相比,主要变化如下:
---增加了双歧杆菌的计数方法;
---增加了 MRS培养基;
---修改了标准的适用范围;
---修改了附录B为可选项。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 双歧杆菌检验
1 范围
本标准规定了双歧杆菌(Bifidobacterium)的鉴定及计数方法。
本标准适用于双歧杆菌纯菌菌种的鉴定及计数。本标准适用于食品中仅含有单一双歧杆菌的菌种
鉴定。本标准适用于食品中仅含有双歧杆菌属的计数,即食品中可包含一个或多个不同的双歧杆菌
菌种。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
2.2 冰箱:2℃~5℃。
2.3 天平:感量0.01g。
2.4 无菌试管:18mm×180mm、15mm×100mm。
2.5 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器(200μL~1000μL)及
配套吸头。
2.6 无菌培养皿:直径90mm。
3 培养基和试剂
3.1 双歧杆菌培养基:见A.1。
3.2 PYG培养基:见A.2。
3.3 MRS培养基:见A.3。
3.4 甲醇:分析纯。
3.5 三氯甲烷:分析纯。
3.6 硫酸:分析纯。
3.7 冰乙酸:分析纯。
3.8 乳酸:分析纯。
4 检验程序
双歧杆菌的检验程序见图1。
图1 双歧杆菌的检验程序
5 操作步骤
5.1 无菌要求
全部操作过程均应遵循无菌操作程序。
5.2 双歧杆菌的鉴定
5.2.1 纯菌菌种
5.2.1.1 样品处理:半固体或液体菌种直接接种在双歧杆菌琼脂平板或 MRS琼脂平板。固体菌种或
真空冷冻干燥菌种,可先加适量灭菌生理盐水或其他适宜稀释液,溶解菌粉。
5.2.1.2 接种:接种于双歧杆菌琼脂平板或MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延长至
72h±2h。
5.2.2 食品样品
5.2.2.1 样品处理:取样25.0g(mL),置于装有225.0mL生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于
8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的
样品匀液。冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45℃的
条件解冻,时间不超过15min。
5.2.2.2 接种或涂布:将上述样品匀液接种在双歧杆菌琼脂平板或 MRS琼脂平板,或取0.1mL适当
稀释度的样品匀液均匀涂布在双歧杆菌琼脂平板或 MRS琼脂平板。36℃±1℃厌氧培养48h±2h,
可延长至72h±2h。
5.2.2.3 纯培养:挑取3个或以上的单个菌落接种于双歧杆菌琼脂平板或 MRS琼脂平板。36℃±
1℃厌氧培养48h±2h,可延长至72h±2h。
5.2.3 菌种鉴定
5.2.3.1 涂片镜检:挑取双歧杆菌平板或 MRS平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色。双歧杆菌
为革兰氏染色阳性,呈短杆状、纤细杆状或球形,可形成各种分支或分叉等多形态,不抗酸,无芽孢,无
动力。
5.2.3.2 生化鉴定:挑取双歧杆菌平板或 MRS平板上生长的双歧杆菌单个菌落,进行生化反应检测。
过氧化氢酶试验为阴性。双歧杆菌的主要生化反应见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生
化鉴定系统。
表1 双歧杆菌菌种主要生化反应
编号 项目
两歧双歧杆菌
(B.bifidum)
婴儿双歧杆菌
(B.infantis)
长双歧杆菌
(B.longum)
青春双歧杆菌
(B.adolescentis)
动物双歧杆菌
(B.animalis)
短双歧杆菌
(B.breve)
1 L-阿拉伯糖 - - + + + -
2 D-核糖 - + + + + +
3 D-木糖 - + + d + +
4 L-木糖 - - - - - -
5 阿东醇 - - - - - -
6 D-半乳糖 d + + + d +
7 D-葡萄糖 + + + + + +
8 D-果糖 d + + d d +
9 D-甘露糖 - + + - - -
10 L-山梨糖 - - - - - -
表1(续)
编号 项目
两歧双歧杆菌
(B.bifidum)
婴儿双歧杆菌
(B.infantis)
长双歧杆菌
(B.longum)
青春双歧杆菌
(B.adolescentis)
动物双歧杆菌
(B.animalis)
短双歧杆菌
(B.breve)
11 L-鼠李糖 - - - - - -
12 卫矛醇 - - - - - -
13 肌醇 - - - - - +
14 甘露醇 - - - -a - -a
15 山梨醇 - - - -a - -a
α-甲 基-D-葡 萄
糖甙
- - + - - -
N-乙 酰-葡 萄
糖胺
- - - - - +
苦杏仁甙(扁桃
甙)
- - - + + -
19 七叶灵 - - + + + -
20 水杨甙(柳醇) - + - + + -
21 D-纤维二糖 - + - d - -
22 D-麦芽糖 - + + + + +
23 D-乳糖 + + + + + +
24 D-蜜二糖 - + + + + +
25 D-蔗糖 - + + + + +
26 D-海藻糖(覃糖) - - - - - -
27 菊糖(菊根粉) - -a - -a - -a
28 D-松三糖 - - + + - -
29 D-棉籽糖 - + + + + +
30 淀粉 - - - + - -
31 肝糖(糖原) - - - - - -
32 龙胆二糖 - + - + + +
33 葡萄糖酸钠 - - - + - -
注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%以上菌株阳性;
a 表示某些菌株阳性。
5.2.3.3 有机酸测定:测定双歧杆菌的有机酸代谢产物(可选项),见附录B。
5.3 双歧杆菌的计数
5.3.1 纯菌菌种
5.3.1.1 固体和半固体样品的制备:以无菌操作称取2.0g样品,置于盛有198.0mL稀释液的无菌均质
杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或置于盛有198.0mL稀释液的无菌均质袋中,用
拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶100的样品匀液。
5.3.1.2 液体样品的制备:以无菌操作量取1.0mL样品,置于9.0mL稀释液中,混匀,制成1∶10的样
品匀液。
5.3.2 食品样品
5.3.2.1 样品处理:取样25.0g(mL),置于装有225.0mL生理盐水的灭菌锥形瓶或均质袋内,于
8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的
样品匀液。冷冻样品可先使其在2℃~5℃条件下解冻,时间不超过18h;也可在温度不超过45℃的
条件解冻,时间不超过15min。
5.3.3 系列稀释及培养
用1mL无菌吸管或微量移液器,制备10倍系列稀释样品匀液,于8000r/min~10000r/min均
质1min~2min,或用拍击式均质器拍打1min~2min。每递增稀释一次,即换用1次1mL灭菌吸管
或吸头。根据对样品浓度的估计,选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液,在进行10倍递增稀释时,吸
取1.0mL样品匀液于无菌平皿内,每个稀释度做两个平皿。同时,分别吸取1.0mL空白稀释液加入
两个无菌平皿内作空白对照。及时将15mL~20mL冷却至46℃的双歧杆菌琼脂培养基或 MRS琼
脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注平皿,并转动平皿使其混合均匀。从样品稀释
到平板倾注要求在15min内完成。待琼脂凝固后,将平板翻转,36℃±1℃厌氧培养48h±2h,可延
长至72h±2h。培养后计数平板上的所有菌落数。
5.3.4 菌落计数
5.3.4.1 可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以
菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。
5.3.4.2 选取菌落数在30CFU~300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU
的平板记录具体菌落数,大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的
平均数。
5.3.4.3 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以
2,代表一个平板菌落数。
5.3.4.4 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。
5.3.5 结果的表述
5.3.5.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平
均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果。
5.3.5.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:
N= 􀰐
(n1+0.1n2)d
(1)
式中:
N ---样品中菌落数;
􀰐C---平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;
n1 ---第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;
n2 ---第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;
d ---稀释因子(第一稀释度)。
5.3.5.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可
记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
5.3.5.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数
计算。
5.3.5.5 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
5.3.5.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于
300CFU时,则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5.3.6 菌落数的报告
5.3.6.1 菌落数小于100CFU时,按“四舍五入”原则修约,以整数报告。
5.3.6.2 菌落数大于或等于100CFU时,第3位数字采用“四舍五入”原则修约后,取前2位数字,后面
用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按“四舍五入”原则修约后,采用两位有效数字。
5.3.6.3 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
5.4 结果与报告
根据5.2.3.1、5.2.3.2,5.2.3.3结果,报告双歧杆菌属的种名。根据5.3.6菌落计数结果出具报告,报
告单位以CFU/g(mL)表示。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 双歧杆菌琼脂培养基
A.1.1 成分
蛋白胨 15.0g
酵母浸膏 2.0g
葡萄糖 20.0g
可溶性淀粉 0.5g
氯化钠 5.0g
西红柿浸出液 400.0mL
吐温80 1.0mL
肝粉 0.3g
琼脂粉 20.0g
加蒸馏水至 1000.0mL
A.1.2 制法
A.1.2.1 半胱氨酸盐溶液的配制:称取半胱氨酸0.5g,加入1.0mL盐酸,使半胱氨酸全部溶解,配制成
半胱氨酸盐溶液。
A.1.2.2 西红柿浸出液的制备:将新鲜的西红柿洗净后称重切碎,加等量的蒸馏水在100℃水浴中加
热,搅拌90min,然后用纱布过滤,校正pH7.0±0.1,将浸出液分装后,121℃高压灭菌15min~
20min。
A.1.2.3 制法:将A.1.1所有成分加入蒸馏水中,加热溶解,然后加入半胱氨酸盐溶液,校正pH至6.8
±0.1。分装后121℃高压灭菌15min~20min。
A.2 PYG液体培养基
A.2.1 成分
蛋白胨 10.0g
葡萄糖 2.5g
酵母粉 5.0g
半胱氨酸-HCl 0.25g
盐溶液 20.0mL
维生素K1 溶液 0.5mL
氯化血红素溶液5mg/mL 2.5mL
加蒸馏水至 500.0mL
A.2.2 制法
A.2.2.1 盐溶液的配制:称取无水氯化钙0.2g,硫酸镁0.2g,磷酸氢二钾1.0g,磷酸二氢钾1.0g,碳酸
氢钠10.0g,氯化钠2.0g,加蒸馏水至1000mL。
A.2.2.2 氯化血红素溶液(5mg/mL)的配制:称取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化钠1.0mL
中,加蒸馏水至100mL,121℃高压灭菌15min~20min。
A.2.2.3 维生素K1 溶液的配制:称取维生素K11.0g,加无水乙醇99.0mL,过滤除菌,避光冷藏保存。
A.2.2.4 制法:除氯化血红素溶液和维生素K1 溶液外,A.2.1其余成分加入蒸馏水中,加热溶解,校正
pH至6.0±0.1,加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min~20min。临用时加热熔化琼脂,加
入氯化血红素溶液和维生素K1 溶液,冷至50℃使用。
A.3 MRS培养基
A.3.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉粉 5.0g
酵母粉 4.0g
葡萄糖 20.0g
吐温80 ......
   
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