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GB 4789.4-2016

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GB 4789.4-2016 英文版 购买 3分钟内自动发货[PDF],有增值税发票。 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验 有效

   
标准详细信息 GB 4789.4-2016; GB4789.4-2016
中文名称: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
英文名称: National food safety standard Food microbiological examination: Salmonella
行业: 国家标准
中标分类: X09
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): GB 4789.4-2010; SN 0170-1992; SN/T 2552.5-2010
标准依据: 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号

GB 4789.4-2016
National food safety standard Food microbiological examination: Salmonella
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替 GB 4789.4-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、
SN0170-1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T 2552.5-2010《乳及乳制品卫
生微生物学检验方法 第5部分:沙门氏菌检验》。
整合后的标准与GB 4789.4-2010相比,主要变化如下:
---修改了检测流程和血清学检测操作程序;
---修改了附录A和附录B。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 冰箱:2℃~5℃。
2.2 恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 电子天平:感量0.1g。
2.6 无菌锥形瓶:容量500mL,250mL。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.8 无菌培养皿:直径60mm,90mm。
2.9 无菌试管:3mm×50mm、10mm×75mm。
2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.11 全自动微生物生化鉴定系统。
2.12 无菌毛细管。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见A.2。
3.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见A.3。
3.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:见A.4。
3.5 HE琼脂:见A.5。
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见A.6。
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 三糖铁(TSI)琼脂:见A.7。
3.9 蛋白胨水、靛基质试剂:见A.8。
3.10 尿素琼脂(pH7.2):见A.9。
3.11 氰化钾 (KCN)培养基:见A.10。
3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.11。
3.13 糖发酵管:见A.12。
3.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见A.13。
3.15 半固体琼脂:见A.14。
3.16 丙二酸钠培养基:见A.15。
3.17 沙门氏菌O、H和Vi诊断血清。
3.18 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图1。
图1 沙门氏菌检验程序
5 操作步骤
5.1 预增菌
无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW的无菌均质杯或合适容器内,以8000r/min~
10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打
1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,用1mol/mL无菌 NaOH 或
HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无
孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。
如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。
同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。
5.3 分离
分别用直径3mm的接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE
琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h
(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板
上的菌落特征见表1。
表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板 沙门氏菌
BS琼脂
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿
色的菌落,周围培养基不变
HE琼脂 蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色
XLD琼脂
菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色
的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心
沙门氏菌属显色培
养基
按照显色培养基的说明进行判定
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于
底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36℃±1℃培养
18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结
果见表2。
表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂
斜面 底层 产气 硫化氢
赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断
K A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属
K A +(-) +(-) - 可疑沙门氏菌属
A A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属
A A +/- +/- - 非沙门氏菌
K K +/- +/- +/- 非沙门氏菌
注:K:产碱,A:产酸;+:阳性,-:阴性;+(-):多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性。
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、
尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接
种。于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存
于2℃~5℃或室温至少保留24h,以备必要时复查。
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应序号 硫化氢 (H2S) 靛基质 pH7.2尿素 氰化钾(KCN) 赖氨酸脱羧酶
A1 + - - - +
A2 + + - - +
A3 - - - - +/-
注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。
5.4.2.1 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异
常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2尿素 氰化钾(KCN) 赖氨酸脱羧酶 判定结果
- - -
甲型副伤寒沙门氏菌(要
求血清学鉴定结果)
- + +
沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符
合本群生化特性)
+ - +
沙门氏菌个别变体(要求
血清学鉴定结果)
注:+表示阳性;-表示阴性。
5.4.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但
需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙
门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别
项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
卫矛醇 + + - - + -
山梨醇 + + + + + -
水杨苷 - - - + - -
ONPG - - + - + -
丙二酸盐 - + + - - -
KCN - - - + + -
注:+表示阳性;-表示阴性。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼
脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生
化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 检查培养物有无自凝性
一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的
玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻
摇动30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自
凝性,反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。
5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,
在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用
无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背
景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如
2%~3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生
理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定
操作同5.5.2。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,待菌落
蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~
2次,自远端取菌培养后再检查。
5.6 血清学分型(选做项目)
5.6.1 O抗原的鉴定
用A~F多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌
株,不能分型。
被A~F多价O血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验。
根据试验结果,判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集
试验,判定E1、E4各亚群,每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果,没有O
单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A~F多价O血清凝集者,先用9种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清
所包括的O群血清逐一检查,以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下:
O多价1 A,B,C,D,E,F群 (并包括6,14群)
O多价2 13,16,17,18,21群
O多价3 28,30,35,38,39群
O多价4 40,41,42,43群
O多价5 44,45,47,48群
O多价6 50,51,52,53群
O多价7 55,56,57,58群
O多价8 59,60,61,62群
O多价9 63,65,66,67群
5.6.2 H抗原的鉴定
属于A~F各O群的常见菌型,依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
表6 A~F群常见菌型 H抗原表
O群 第1相 第2相
C1
C2
D(不产气的)
D(产气的)
E1
E4
E4
g,f,s
i,b,d
k,v,r,c
b,d,r
g,m,p,q
h,v
g,s,t
5,z15
2,5
6,w,x
不常见的菌型,先用8种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血
清所包括的各种H因子血清逐一检查,以第1相和第2项的 H抗原。8种多价 H血清所包括的 H因
子如下:
H多价1 a,b,c,d,i
H多价2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H多价3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H多价5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H多价6 z39,z41,z42,z44
H多价7 z52,z53,z54,z55
H多价8 z56,z57,z60,z61,z62
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果,没有 H单因子血清的要用两
个H复合因子血清进行核对。
检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可
在琼脂斜面上移种1代~2代后再检查。如仍只检出一个相的 H抗原,要用位相变异的方法检查其另
一个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下:
简易平板法:将0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板
表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌
苔边缘取菌检查。
小玻管法:将半固体管(每管约1mL~2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃,取已知相的 H因子血
清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻
管内,待凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,
以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。
培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般
按原血清1∶200~1∶800的量加入。
小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上
端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50℃,挑取因子血清1环,
加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,待凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层
内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,
于36℃培养后再做凝集试验。
5.6.3 Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙
门氏菌。
5.6.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果,按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水) 9.0g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,高压灭菌121℃,
15min。
A.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
A.2.1 基础液
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 5.0g
氯化钠 3.0g
碳酸钙 45.0g
蒸馏水 1000mL
除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH至7.0±0.2,高压灭菌121℃,
20min。
A.2.2 硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠(含5个结晶水) 50.0g
蒸馏水 加至100mL
高压灭菌121℃,20min。
A.2.3 碘溶液
碘 片 20.0g
碘化钾 25.0g
蒸馏水 加至100mL
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水
至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。
A.2.4 0.5%煌绿水溶液
煌绿 0.5g
蒸馏水 100mL
溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。
A.2.5 牛胆盐溶液
牛胆盐 10.0g
蒸馏水 100mL
加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121℃,20min。
A.2.6 制法
基础液 900mL
硫代硫酸钠溶液 100mL
碘溶液 20.0mL
煌绿水溶液 2.0mL
牛胆盐溶液 50.0mL
临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种
成分。
A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨 5.0g
乳糖 4.0g
磷酸氢二钠 10.0g
亚硒酸氢钠 4.0g
L-胱氨酸 0.01g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55℃以下,以无菌操作加入
亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液15mL,使溶
解,再加无菌蒸馏水至100mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH至7.0±0.2。
A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 5.0g
葡萄糖 5.0g
硫酸亚铁 0.3g
磷酸氢二钠 4.0g
煌绿 0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL
柠檬酸铋铵 2.0g
亚硫酸钠 6.0g
琼脂 18.0g~20.0g
蒸馏水 1000mL
A.4.2 制法
将前三种成分加入300mL蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏
水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中,琼脂加入600mL蒸馏水中。然
后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至80℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。
将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH至7.5±0.2,随即倾入琼脂液中,混合
均匀,冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48h会降低其
选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.5 HE 琼脂(HektoenEntericAgar)
A.5.1 成分
蛋白胨 12.0g
牛肉膏 3.0g
乳糖 12.0g
蔗糖 12.0g
水杨素 2.0g
胆盐 20.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 18.0g~20.0g
蒸馏水 1000mL
0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16.0mL
Andrade指示剂 20.0mL
甲液 20.0mL
乙液 20.0mL
A.5.2 制法
将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别
搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH至7.5±0.2。再加入指示剂,并与琼脂液
合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠 34.0g
柠檬酸铁铵 4.0g
蒸馏水 100mL
③乙液的配制
去氧胆酸钠 10.0g
蒸馏水 100mL
④Andrade 指示剂
酸性复红 0.5g
1mol/L氢氧化钠溶液 16.0mL
蒸馏水 100mL
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1mL~
2mL。
A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
A.6.1 成分
酵母膏 3.0g
L-赖氨酸 5.0g
木糖 3.75g
乳糖 7.5g
蔗糖 7.5g
去氧胆酸钠 2.5g
柠檬酸铁铵 0.8g
硫代硫酸钠 6.8g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
酚红 0.08g
蒸馏水 1000mL
A.6.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.4±0.2。另将琼脂加
入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。本培养基宜于当
天制备,第二天使用。
A.7 三糖铁(TSI)琼脂
A.7.1 成分
蛋白胨 20.0g
牛肉膏 5.0g
乳 糖 10.0g
蔗 糖 10.0g
葡萄糖 1.0g
硫酸亚铁铵(含6个结晶水) 0.2g
酚红 0.025g或5.0g/L溶液5.0mL
氯化钠 5.0g
硫代硫酸钠 0.2g
琼脂 12.0g
蒸馏水 1000mL
A.7.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.4±0.2。另将琼脂加
入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约2mL~4mL,高压灭菌121℃
10min或115℃15min,灭菌后制成高层斜面,呈桔红色。
A.8 蛋白胨水、靛基质试剂
A.8.1 蛋白胨水
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0g
氯化钠 5.0g
蒸馏水 1000mL
将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.4±0.2,分装小试管,121℃高压灭菌15min。
A.8.2 靛基质试剂
A.8.2.1 柯凡克试剂:将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。
A.8.2.2 欧-波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸
20mL。
A.8.3 试验方法
挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d~2d,必要时可培养4d~5d。加入柯凡克试剂约
0.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5mL,沿管壁流下,覆盖于培养液
表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注:蛋白胨中应含有丰富的色氯酸。每批蛋白胨买来后,应先用已知菌种鉴定后方可使用。
A.9 尿素琼脂(pH7.2)
A.9.1 成分
蛋白胨 1.0g
氯化钠 5.0g
葡萄糖 1.0g
磷酸二氢钾 2.0g
0.4%酚红 3.0mL
琼脂 20.0g
蒸馏水 1000mL
20%尿素溶液 100mL
A.9.2 制法
除尿素、琼脂和酚红外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2。另将
琼脂加入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂后分装,121℃高压灭菌15min。冷至50℃~55℃,加
入经除菌过滤的尿素溶液。尿素的最终浓度为2%。分装于无菌试管内,放成斜面备用。
A.9.3 试验方法
挑取琼脂培养物接种,在36℃±1℃培养24h,观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变
为红色。
A.10 氰化钾(KCN)培养基
A.10.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸二氢钾 0.225g
磷酸氢二钠 5.64g
蒸馏水 1000mL
0.5%氰化钾 20.0mL
A.10.2 制法
将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,分装后121℃高压灭菌15min。放在冰箱内使
其充分冷却。每100mL培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0mL(最后浓度为1∶10000),分装于无菌试
管内,每管约4mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在4℃冰箱内,至少可保存两个月。同时,将不加氰化钾
的培养基作为对照培养基,分装试管备用。
A.10.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取1环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另挑取
1环接种于对照培养基。在36℃±1℃培养1d~2d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑制),经
2d细菌不生长为阴性(抑制)。
注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原
因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。
试验时对每一环节都要特别注意。
A.11 赖氨酸脱羧酶试验培养基
A.11.1 成分
蛋白胨 5.0g
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
蒸馏水 1000mL
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0mL
L-赖氨酸或DL-赖氨酸 0.5g/100mL或1.0g/100mL
A.11.2 制法
除赖氨酸以外的成分加热溶解后,分装每瓶100mL,分别加入赖氨酸。L-赖氨酸按0.5%加入,
DL-赖氨酸按1%加入。调节pH至6.8±0.2。对照培养基不加赖氨酸。分装于无菌的小试管内,每管
0.5mL,上面滴加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。
A.11.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于36℃±1℃培养18h~24h,观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者
由于产碱,培养基应呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管应为
黄色。
A.12 糖发酵管
A.12.1 成分
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
氯化钠 3.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水) 2.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12.0mL
蒸馏水 1000mL
A.12.2 制法
A.12.2.1 葡萄糖发酵管按上述成分配好后,调节pH至7.4±0.2。按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个
倒置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min。
A.12.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min。另将各
种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入于100mL培养基内,以无菌操作分装
小试管。
注:蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
A.12.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取小量培养物接种,于36℃±1℃培养,一般2d~3d。迟缓反应需观察14d~
30d。
A.13 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基
A.13.1 成分
邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)
(O-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside)
60.0mg
0.01mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.5) 10.0mL
1%蛋白胨水(pH7.5) 30.0mL
A.13.2 制法
将ONPG溶于缓冲液内,加入蛋白胨水,以过滤法除菌,分装于无菌的小试管内,每管0.5mL,用
橡皮塞塞紧。
A.13.3 试验方法
自琼脂斜面上挑取培养物1满环接种于36℃±1℃培养1h~3h和24h观察结果。如果β-半乳
糖苷酶产生,则于1h~3h变黄色,如无此酶则24h不变色。
A.14 半固体琼脂
A.14.1 成分
牛肉膏 0.3g
蛋白胨 1.0g
氯化钠 0.5g
琼脂 0.35g~0.4g
蒸馏水 100mL
A.14.2 制法
按以上成分配好,煮沸溶解,调节pH至7.4±0.2。分装小试管。121℃高压灭菌15min。直立凝
固备用。
注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。
A.15 丙二酸钠培养基
A.15.1 成分
酵母浸膏 1.0g
硫酸铵 2.0g
磷酸氢二钾 0.6g
磷酸二氢钾 0.4g
氯化钠 2.0g
丙二酸钠 3.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12.0mL
蒸馏水 1000mL
A.15.2 制法
除指示剂以外的成分溶解于水,调节pH至6.8±0.2,再加入指示剂,分装试管,121℃高压灭菌
15min。
A.15.3 试验方法
用新鲜的琼脂培养物接种,于36℃±1℃培养48h,观察结果。阳性者由绿色变为蓝色。
附 录 B
常见沙门氏菌抗原
常见沙门氏菌抗原见表B.1。
表B.1 常见沙门氏菌抗原表
菌名 拉丁菌名 O抗原
H抗原
第1相 第2相
A 群
甲型副伤寒沙门氏菌 S .ParatyphiA 1,2,12 a [1,5]
B 群
基桑加尼沙门氏菌 S.Kisangani 1,4,[5],12 a 1,2
阿雷查瓦莱塔沙门氏菌 S.Arechavaleta 4,[5],12 a 1,7
马流产沙门氏菌 S.Abortusequi 4,12 - e,n,x
乙型副伤寒沙门氏菌 S.ParatyphiB 1,4,[5],12 b 1,2
利密特沙门氏菌 S.Limete 1,4,12,[27] b 1,5
阿邦尼沙门氏菌 S.Abony 1,4,[5],12,27 b e,n,x
维也纳沙门氏菌 S.Wien 1,4,12,[27] b l,w
伯里沙门氏菌 S.Bury 4,12,[27] c z6
斯坦利沙门氏菌 S.Stanley 1,4,[5],12,[27] d 1,2
圣保罗沙门氏菌 S.Saintpaul 1,4,[5],12 e,h 1,2
里定沙门氏菌 S.Reading 1,4,[5],12 e,h 1,5
彻斯特沙门氏菌 S.Chester 1,4,[5],12 e,h e,n,x
德尔卑沙门氏菌 S.Derby 1,4,[5],12 f,g [1,2]
阿贡纳沙门氏菌 S.Agona 1,4,[5],12 f,g,s [1,2]
埃森沙门氏菌 S.Essen 4,12 g,m -
加利福尼亚沙门氏菌 S.California 4,12 g,m,t [z67]
金斯敦沙门氏菌 S.Kingston 1,4,[5],12,[27] g,s,t [1,2]
布达佩斯沙门氏菌 S.Budapest 1,4,12,[27] g,t -
鼠伤寒沙门氏菌 S.Typhimurium 1,4,[5],12 i 1,2
拉古什沙门氏菌 S.Lagos 1,4,[5],12 i 1,5
布雷登尼沙门氏菌 S.Bredeney 1,4,12,[27] l,v 1,7
基尔瓦沙门氏菌Ⅱ S.KilwaⅡ 4,12 l,w e,n,x
海德尔堡沙门氏菌 S.Heidelberg 1,4,[15],12 r 1,2
印地安纳沙门氏菌 S.Indiana 1,4,12 z 1,7
表B.1(续)
菌名 拉丁菌名 O抗原
H抗原
第1相 第2相
斯坦利维尔沙门氏菌 S.Stanleyvile 1,4,[5],12,[27] z4,z23 [1,2]
伊图里沙门氏菌 S.Ituri 1,4,12 z10 1,5
C1 群
奥斯陆沙门氏菌 S.Oslo 6,7,14 a e,n,x
爱丁保沙门氏菌 S.Edinburg 6,7,14 b 1,5
布隆方丹沙门氏菌Ⅱ S.BloemfonteinⅡ 6,7 b [e,n,x]:z42
丙型副伤寒沙门氏菌 S.ParatyphiC 6,7,[Vi] c 1,5
猪霍乱沙门氏菌 S.Choleraesuis 6,7 c 1,5
猪伤寒沙门氏菌 S.Typhisuis 6,7 c 1,5
罗米他沙门氏菌 S.Lomita 6,7 e,h 1,5
布伦登卢普沙门氏菌 S.Braenderup 6,7,14 e,h e,n,z15
里森沙门氏菌 S.Rissen 6,7,14 f,g -
蒙得维的亚沙门氏菌 S.Montevideo 6,7,14 g,m,[p],s [1,2,7]
里吉尔沙门氏菌 S.Riggil 6,7 g,[t] -
奥雷宁堡沙门氏菌 S.Oranieburg 6,7,14 m,t [2,5,7]
奥里塔蔓林沙门氏菌 S.Oritamerin 6,7 i 1,5
汤卜逊沙门氏菌 S.Thompson 6,7,14 k 1,5
康科德沙门氏菌 S.Concord 6,7 l,v 1,2
伊鲁木沙门氏菌 S.Irumu 6,7 l,v 1,5
姆卡巴沙门氏菌 S.Mkamba 6,7 l,v 1,6
波恩沙门氏菌 S.Bonn 6,7 l,v e,n,x
波茨坦沙门氏菌 S.Potsdam 6,7,14 l,v e,n,z15
格但斯克沙门氏菌 S.Gdansk 6,7,14 l,v z6
维尔肖沙门氏菌 S.Virchow 6,7,14 r 1,2
婴儿沙门氏菌 S.Infantis 6,7,14 r 1,......
   
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