路径: 主页 > GB > 第26页 > GB 31615.2-2025 | 标准编号 | GB 31615.2-2025 (GB31615.2-2025) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品用菌种安全性评价程序 | | 英文名称 | National food safety standard - Safety evaluation procedures for food bacteria | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 28,212 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局 | GB 31615.2-2025
National food safety standard - Safety evaluation procedures for food bacteria
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品用菌种安全性评价程序
2025-03-16发布
2026-03-16实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
食品安全国家标准
食品用菌种安全性评价程序
1 范围
本标准规定了食品用菌种(包括细菌、放线菌、丝状真菌、酵母及单细胞藻类)的安全性评价程序。
本标准适用于食品、食品添加剂用活的微生物菌种(包括细菌、放线菌、丝状真菌、酵母及单细胞藻
类)的安全性评价。
本标准不适用于遗传修饰微生物的安全性评价。
2 术语和定义
2.1 致病性
微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力。
2.2 产毒能力
微生物产生对生物体有损伤作用物质的能力。
2.3 毒性
微生物有毒代谢产物引起的宿主健康损伤。
2.4 抗菌药物耐药性
微生物对抗菌药物的抗性,耐药性又分为固有耐药(又称天然耐药)和获得性耐药两类。
2.5 固有耐药性
微生物对抗菌药物的天然耐药,反映了1个种内所有或几乎所有野生型菌株的抗菌模式。一种由
微生物基因组基因决定且代代相传、不依赖于基因的水平转移或染色体定位基因的自发突变且不随着
物种的系统发育进化而消失或出现的特性,与抗菌药物的存在无关。
2.6 获得性耐药
当微生物接触抗菌药物后,原来敏感的微生物发生基因突变或获得外源性耐药基因而改变自身的
代谢途径,使其能避免被药物抑制或杀灭。可由水平转移元件(如质粒、转座子、整合子等)介导,或由染
色体突变引起。
2.7 最低抑菌浓度
在规定的体外试验条件下、规定的时间内,可观察到抑制微生物生长的最低药物浓度(minimum
2.8 全基因组测序
在1次测序中确定1个生物体DNA序列(包括生物体的全部染色体、质粒、线粒体以及植物叶绿
体等)的操作过程。
2.9 诱变
通过物理方法、化学诱变剂、生物因子诱发生物体遗传物质发生1个或多个突变的过程,其变种的
发生频率显著高于自发突变。
3 拟评价微生物菌种的基本资料
3.1 基本信息
包括菌种名称(包括中文名、拉丁名、别名等)、来源及用途。
3.2 分类学资料
包括规范、科学的菌种分类学(属、种、亚种等)资料。当菌种分类学地位发生变化时,还应包含其重
新分类后的名称及曾用名。
3.3 鉴定资料
包括基于表型和基因型的菌种鉴定资料。
3.4 生长环境条件资料
包括适宜于菌种生长的培养基及培养条件(包括但不限于培养时间、培养温度和湿度、需氧情况、光
照等),以及菌种的保藏及复壮方法等。
3.5 诱变菌种的资料
经诱变的菌种,应包括其详细的诱变方法(包括使用的诱变剂、诱变条件及诱变试验流程等),以及
诱变后其表型和基因型等发生的变化。
3.6 遗传稳定性资料
包括1个生产周期内最多传代次数2倍以上代数的菌种关键指标或特征的遗传稳定性资料。
3.7 生产相关信息
包括但不限于菌种用于食品、食品添加剂等生产的原辅料记录、产品配方、工艺流程、技术要求或企
业标准等资料。
3.8 其他资料
需要说明的其他技术资料。
4 评价方法
在掌握3.1~3.8所列资料基础上,对微生物菌种按照以下方法开展安全性评价:
a) 国内外安全性评价资料分析:对菌种国内、国外使用历史及安全性(包括但不限于其致病性和
产毒能力报告、临床试验资料、科技文献或综述等)进行综合分析。若无上述资料,应对同种内
其他株或在亲缘关系上与其相近种属菌种的使用历史和安全性评价资料(包括但不限于与该
菌种的亲缘性关系说明、基因序列匹配度分析等)进行分析。
b) 全基因组测序:对菌种进行全基因组测序,分别获得其基因组框架图和完成图(藻类除外),并
对测序数据的毒力基因、耐药基因、毒素产生相关基因等进行综合分析。
c) 动物致病性试验:分别参照附录A~附录D的方法或其他等效方法进行动物致病性试验,并
对试验结果进行评价。
d) 耐药性试验:参照附录E中的方法或其他等效方法,对细菌菌种进行耐药性试验,同时结合全基
因组测序获得的基因组完成图中耐药基因携带情况,进行综合评价。
e) 产毒试验:对细菌菌种,应对其基因组中产毒基因携带及表达情况进行综合分析与评价。若携
带产毒基因且能表达,应参照生产条件进行包括生产用培养基在内的多种基质中(单品种固
体、多品种固体复合、不同成分液体组合等)的产毒试验。产毒试验的培养时间应不短于1个
产品生产周期,并按照食品安全国家标准规定的检验方法或其他等效方法进行毒素(或抗菌物
质)含量(或活性)检测。
对真菌菌种,其产毒试验应参照附录F中的方法进行,并按照食品安全国家标准规定的检验
方法或其他等效方法进行真菌毒素含量的测定。
放线菌产生的抗菌物质或藻类产生的藻类毒素应按照相应食品安全国家标准规定的检验方法
或其他等效方法进行检验。
若产毒试验显示受试菌种产生毒素(或抗菌物质),则应根据产生毒素(或抗菌物质)的水平,并
结合人群对用该菌种生产食品的摄入量,评估其对人群健康的影响。
f) 毒理学试验:对国内外均无食用习惯的菌种,应进行急性经口毒性试验/致病性试验、3项遗传
毒性试验、90天经口毒性试验、致畸试验和生殖毒性试验。仅在国外个别国家或国内局部地
区有食用习惯的菌种,应进行急性经口毒性试验/致病性试验、3项遗传毒性试验、90天经口毒
性试验;已在多个国家批准食用的菌种,可进行急性经口毒性试验/致病性试验、2项遗传毒性
试验。其中,2项遗传毒性试验包括细菌回复突变试验和哺乳动物红细胞微核试验,3项遗传
毒性试验按照GB 15193.1《食品安全国家标准 食品安全性毒理学评价程序》中规定的遗传
毒性试验组合进行。
g) 其他活性物质测定:直接添加到供1岁以下婴儿食用食品中的菌种,还应按照食品安全国家标
准规定的检验方法或其他等效方法进行D-乳酸的测定。
具有溶血活性或可产生其他代谢产物的菌种,还应按照食品安全国家标准规定的检验方法或
其他等效方法进行溶血活性物质或相关代谢产物的测定。
5 结果判定
5.1 致病性及产毒能力完全符合以下3种情况者认为该菌种是安全的:
a) 全基因组序列分析结果显示不存在已知的毒力/致病相关基因或毒素合成关键基因;或存在可
能与致病相关的基因,但根据菌种的功能特性及文献资料排除该基因与宿主致病相关。
b) 动物试验显示无致病性。
c) 产毒试验结果显示在受试的所有基质中均不产生已知的、危害人类健康的活性代谢产物。
5.2 全基因组序列中发现含有已知毒力/致病基因或毒素合成关键基因,但动物试验显示不具有致病
性,或产毒试验显示在受试的培养基中可产生已知的有毒活性代谢产物但水平较低,评估结果表明长期
摄入对人体健康无影响,结合国内外安全使用历史,可认为该菌种是安全的。
5.3 全基因组测序结果显示存在已知毒力/致病或毒素合成关键基因,且动物试验显示具有致病性或
产生高水平已知的有毒代谢产物,长期摄入可能影响人体健康,认为该菌种是不安全的。
5.4 以下耐药性的判定原则仅适用于5.1及5.2中已确认为安全的细菌菌种:
a) 对受试抗菌药物无耐药性,表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的 MIC值低于设定的阈
值,且全基因组序列中未检测到与耐药表型直接相关的耐药基因,或检测到与耐药表型直接相
关的耐药基因但经试验证实其不介导耐药,则认为该菌种是安全的。
b) 对受试抗菌药物具有固有耐药性,表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的 MIC值高于设定
的阈值,且其携带的耐药基因位于染色体上,通过水平传播的可能性很小,认为该菌种是安
全的。
c) 对受试抗菌药物产生获得性耐药,表现为菌种对1种或几种受试抗菌药物的 MIC值高于设定
的阈值,若产生耐药的机制是染色体突变所致,其水平传播的可能性很低,一般认为该菌种是
安全的。
d) 菌种对1种或几种抗菌药物的 MIC值高于设定的阈值,若全基因组测序分析结果显示耐药决
定子位于可移动遗传元件上,具有水平传播的潜力,则认为该菌种是不安全的。
e) 若该菌种基因组中存在对世界卫生组织关于人类医学至关重要抗菌药物和高度重要抗菌药物
列表中规定的抗生素耐药基因,则应结合其 MIC值进行综合判定:
---若 MIC值高于设定的阈值,则认为该菌种是不安全的;
---若 MIC值低于设定的阈值,则应评估该耐药基因表达的可能性,若能表达,则认为该菌种
是不安全的。
附 录 A
食品用细菌致病性试验方法
A.1 范围
本方法规定了食品用细菌的致病性试验方法。
本方法适用于食品用细菌的致病性评价。
A.2 设备和材料
除微生物实验室常规设备外,其他设备与材料如下。
A.2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
A.2.2 离心机:离心力≥3000g。
A.2.3 电子天平:感量分别为0.1g和0.001g。
A.2.4 比浊仪。
A.2.5 温湿度计。温度计允许误差:±1℃,湿度计允许误差:±3% RH。
A.2.6 显微镜:10×~100×。
A.2.7 厌氧培养装置:厌氧罐(袋、盒等)或厌氧培养箱。
A.2.8 无菌锥形瓶:容量100mL、500mL。
A.2.9 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
A.2.10 无菌试管:16mm×160mm。
A.2.11 无菌培养皿:直径90mm。
A.2.12 无菌量筒:容量100mL。
A.2.13 微量移液器及配套吸头:量程为100μL~1000μL。
A.2.14 注射器:量程为100μL~1000μL。
A.2.15 小鼠灌胃针头。
A.2.16 无菌微孔滤膜:孔径0.22μm。
A.3 培养基和试剂
A.3.1 无菌生理盐水:0.85%的商品化生理盐水或8.5gNaCl溶于1000mL蒸馏水中,分装后121℃
高压灭菌15min,备用。
A.3.2 LB(Luria-Bertan,LB)肉汤培养基:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解
后分装,121℃高压灭菌15min,备用。
A.3.3 LB琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压
灭菌15min,制备LB琼脂平板,备用。
A.3.4 半胱氨酸盐酸盐储备液:称取500mg半胱氨酸盐酸盐于50mL无菌离心管中,加入10mL蒸
馏水,充分溶解后用0.22μm无菌微孔滤膜过滤除菌,备用。
说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15min,待培养基冷却至50℃左右时,加入
A.3.4中制备的半胱氨酸盐酸盐储备液,使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL,备用。
A.3.6 含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS琼脂平板:商品化的 MRS琼脂培养基按照产品说明书用蒸馏水
配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15min,待培养基冷却至50℃左右时,加入A.3.4中制备
的半胱氨酸盐酸盐储备液,使培养基中半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL,制备含有半胱氨酸盐
酸盐的 MRS琼脂平板,备用。
A.3.7 含有半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板:商品化的双歧杆菌琼脂培养基按照产品说明书用蒸
馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高压灭菌15min,待培养基冷却至50℃左右时,加入A.3.4中
制备的半胱氨酸盐酸盐储备液,使半胱氨酸盐酸盐的终浓度为500μg/mL,制备含有半胱氨酸盐酸盐
的双歧杆菌琼脂平板,备用。
A.4 实验动物
选用SPF级昆明或ICR健康成年小鼠,雌雄各半,体重范围为18.0g~22.0g。动物质量、实验室
管理、试验条件等符合GB/T 35823《实验动物 动物实验通用要求》的规定。
A.5 操作步骤
对于国内外均无使用历史的菌种,或国内外虽有使用历史,但对人和动物健康有不良影响记载或报
道的菌种,必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物,以评价受试物不同给予途径对动物
的致病性。
对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种,可选择经口灌胃
单一途径给予动物受试物,以评价受试物对动物的致病性。
A.5.1 腹腔注射
A.5.1.1 菌种活化:目前我国食品用细菌菌种主要是双歧杆菌属、乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌
属、乳植杆菌属、联合乳杆菌属、广布乳杆菌属等,除这些属以外,其他菌种在以下描述中均使用“其他细
菌”。根据送检菌种的保存状态,将双歧杆菌、乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合
乳杆菌属、广布乳杆菌属接种含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS肉汤培养基、其他细菌接种LB肉汤培养基
(或适于该菌生长的最适液体培养基中)活化(或传代使活力达到最佳),并置适宜的培养条件(包括培养
温度、湿度、厌氧、需氧、微需氧等)下培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异),确认为纯培养后
备用。
A.5.1.2 菌悬液制备:将A.5.1.1中活化的双歧杆菌接种含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS琼脂平板或含有
半胱氨酸盐酸盐的双歧杆菌琼脂平板;乳杆菌属、乳酪杆菌属、粘液乳杆菌属、乳植杆菌属、联合乳杆菌
属、广布乳杆菌属接种含有半胱氨酸盐酸盐的 MRS琼脂平板,其他细菌接种LB琼脂平板或适应于该
菌生长的最适培养基琼脂平板,在规定的适宜培养条件(包括培养温度、湿度、厌氧、有氧、微需氧等)下
培养一定时间(培养时间长短视不同菌种而异)后,刮取平板上的菌落,将其悬浮于无菌生理盐水中,充
分混匀后,用适量无菌生理盐水调整菌悬液浊度,使最终菌悬液中的菌浓度为5.0×107CFU/mL,用于
小鼠腹腔注射。
A.5.1.3 腹腔注射:小鼠不少于40只,雌雄各半,随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠无菌生
理盐水对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠无菌生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组。注射量为0.2mL/只,
即受试物组每只小鼠注射菌量至少1.0×107CFU。
A.5.1.4 动物观察:动物腹腔注射后每天观察1次,连续观察至少21d。观察并记录小鼠皮肤和毛、眼
睛和黏膜、呼吸情况、肢体活动、行为方式等有无异常。特别注意观察是否出现震颤、抽搐、腹泻、嗜睡、
流涎和昏迷等现象。试验前称量并记录所有小鼠的体重,试验结束后称量并记录所有存活小鼠的体重。
对于试验期间死亡的小鼠,尽可能精确记录小鼠的死亡时间,同时称重并记录。
A.5.2 经口灌胃
A.5.2.1 菌数预估
无菌吸取A.5.1.1的培养液,分别加至2个无菌离心管中,每管1mL,3000g离心10min,弃去上清
液后,用适量无菌生理盐水调整菌悬液浊度,使最终菌悬液中菌的浓度分别不低于2.5×108CFU/mL和
1.25×109CFU/mL,并分别记录每毫升培养液离心后所得沉淀物中细菌数调整至2.5×108CFU/mL
和1.25×109CFU/mL时需加入的无菌生理盐水的体积(mL)。
A.5.2.2 菌悬液制备
A.5.2.2.1 培养上清液的制备:根据受试动物总数和每只动物的灌胃体积计算所需要的受试菌种培养
液用量,吸取A.5.1.1培养液,将培养液一分为二,3000g各离心10min后,将上清液分别转至100mL
无菌量筒中,1份上清液用于菌悬液原液的制备,另1份上清液冷冻浓缩至原体积的1/5,作为5倍浓缩
上清液,备用。
A.5.2.2.2 菌悬液原液的制备:按照A.5.2.1中获得的细菌终浓度达到2.5×108CFU/mL所需要的生
理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入A.5.2.2.1获得的上清液,调整离心后的沉淀物使
其细菌数达到2.5×108CFU/mL(上清液量不够时可用空白培养基补齐)。
A.5.2.2.3 5倍浓缩菌悬液的制备:按照A.5.2.1中获得的细菌终浓度达到1.25×109CFU/mL所需要
的生理盐水体积,根据离心的培养物体积,按相同比例加入A.5.2.2.1获得的5倍浓缩上清液,调整离心
后的沉淀物使其细菌数达到1.25×109CFU/mL。
A.5.2.3 灌胃
小鼠不少于80只,雌雄各半,随机分成8组(每组不少于10只),包括雄性小鼠培养基对照组、雄性
小鼠菌悬液组、雄性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雄性小鼠5倍浓缩菌悬液组、雌性小鼠培养基对照组、
雌性小鼠菌悬液组、雌性小鼠5倍浓缩培养基对照组、雌性小鼠5倍浓缩菌悬液组。各组均以20mL/kg
体重的体积给小鼠灌胃,使受试物组每只小鼠灌胃菌量分别为1.0×108CFU(原液组)和5.0×108CFU
(5倍浓缩液组),连续灌胃3d。首次灌胃前动物禁食过夜(16h),灌胃后3h~4h喂食。
A.5.2.4 观察
动物经口灌胃后每天观察1次,至少连续观察21d,观察指标同A.5.1.4。
A.6 结果与报告
对A.5.1和A.5.2的动物试验结果进行统计学分析和综合评价,包括:
a) 受试物对动物一般健康情况有无不良影响;
b) 受试物对动物体重等指标的影响;
c) 受试物组动物死亡情况;
d) 对受试物组和相应对照组小鼠的体重分别进行独立样本t检验,检验标准为α=0.05。若受试
物组动物在试验期间未出现中毒症状或死亡,且体重等指标与对照组相比差异无统计学意义,
即可判定该菌种无致病性;若受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡,或试验期间体重
等指标与对照组相比有显著性差异,即可判定该菌种具有致病性。
附 录 B
食品用丝状真菌的致病性试验方法
B.1 范围
本方法规定了食品用丝状真菌的致病性试验方法。
本方法适用于食品用丝状真菌的致病性评价。
B.2 设备和材料
除微生物实验室常规设备外,其他设备和材料如下。
B.2.1 恒温培养箱:28℃±1℃。
B.2.2 电子天平:感量为0.1g。
B.2.3 锥形瓶:容量为500mL。
B.2.4 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
B.2.5 显微镜:10×~100×。
B.2.6 微量移液器及配套吸头:量程为100μL~1000μL。
B.2.7 血球计数板。
B.2.8 注射器:量程为100μL~1000μL。
B.2.9 小鼠灌胃针头。
B.2.10 温湿度计。温度计允许误差:±1℃,湿度计允许误差:±3% RH。
B.2.11 接种钩。
B.2.12 球磨仪或功能相当的仪器。
B.2.13 无菌培养皿:直径90mm。
B.3 培养基和试剂
B.3.1 无菌生理盐水:见A.3.1。
B.3.2 麦芽汁琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,121℃高
压灭菌15min,制备麦芽汁琼脂平板,备用。
B.3.3 马铃薯葡萄糖琼脂平板:商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配制,充分加热溶解后分装,
121℃高压灭菌15min,制备马铃薯葡萄糖琼脂平板,备用。
如菌种在上述2种培养基上的生长状态和产孢子量均不理想,可选用适于该菌种生长和产孢的其
他培养基。
B.4 实验动物
见A.4。
B.5 操作步骤
对于国内外均无使用历史的菌种,或国内外虽有使用历史,但对人和动物健康有不良影响记载或报
道的菌种,必须使用腹腔注射和经口灌胃2种途径给予动物受试物,以评价受试物不同给予途径对动物
的致病性。
对于国内外有使用历史且使用过程中未发现对人和动物健康有不良影响的菌种,可选择经口灌胃
单一途径给予动物受试物,以评价受试物对动物的致病性。
B.5.1 腹腔注射
B.5.1.1 菌种活化
将送检菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板(红曲霉接种于麦芽汁琼脂平板)或适于该菌生长的最适
培养基中,并置于适宜的培养条件下(包括培养温度、湿度、光照、通气量等)培养一定时间(培养时间长
短视不同菌种而异),确认为纯培养后备用。
B.5.1.2 菌悬液制备
B.5.1.2.1 产孢子量大的菌种:将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板(红曲霉属菌种接种麦芽汁琼脂
平板)或适于菌种生长的培养基平板,28℃±1℃培养7d~14d后,挑取平板上的孢子,将其悬浮于无
菌生理盐水中,充分混匀后,用血球计数板计数孢子浓度,并用适量无菌生理盐水调整,使其最终浓度不
低于5.0×107CFU/mL。
B.5.1.2.2 产孢子量少或不产孢子的菌种:将菌种接种于适宜的培养基上,28℃±1℃下培养7d~
14d或在适宜的诱导产孢条件下培养一定时间后,挑取平板上的菌丝体及孢子,用球磨仪(或其他功能
相当的仪器)将菌丝体磨碎,并用生理盐水重悬后,用血球计数板计数,并用适量无菌生理盐水调整,使
菌悬液中菌丝体片段数/孢子的最终浓度不低于5.0×107CFU/mL。
B.5.1.3 腹腔注射
小鼠不少于40只,雌雄各半,随机分成4组(每组不少于10只),包括雄性小鼠生理盐水对照组、雄
性小鼠菌悬液组、雌性小鼠生理盐水对照组、雌性小鼠菌悬液组,每只小鼠注射0.2mL,即受试物组每
只小鼠注射的菌量至少为1.0×107CFU。
B.5.1.4 动物观察
动物腹腔注射后每天观察1次,至少连续观察21d,观察指标同A.......
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