标准搜索结果: 'GB 4789.9-2025'
| 标准编号 | GB 4789.9-2025 (GB4789.9-2025) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验 | | 英文名称 | National food safety standard - Food microbiological examination - Examination of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 字数估计 | 16,182 | | 发布日期 | 2025-09-02 | | 发布机构 | National Health Commission; State Administration for Market Regulation | GB 4789.9-2025: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验
空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验
2025-09-02发布
2026-03-02实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB 4789.9-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验》。
本标准与GB 4789.9-2014相比,主要变化如下:
---修改了标准的名称;
---修改了标准的范围;
---增加了实时荧光PCR鉴定方法和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定方法;
---修改了设备和材料、培养基和试剂、检验程序、操作步骤;
---修改了附录。
食品安全国家标准
食品微生物学检验
空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验
1 范围
验方法。
本标准适用于食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌、培养及分子检测设备外,其他设备和材料如下。
2.1 冰箱:2℃~8℃、-18℃~-20℃。
2.2 恒温培养箱:25℃±1℃、36℃±1℃、42℃±1℃。
2.3 拍击式均质器。
2.4 无菌带滤网均质袋。
2.5 电子天平:感量0.1g,感量0.01g,感量0.001g。
2.6 恒温水浴或金属浴装置:36℃~100℃。
2.7 振荡器。
2.8 无菌培养皿:直径60mm、90mm。
2.9 无菌亲水性滤膜:直径47mm,孔径0.45μm。
2.10 微需氧培养装置:提供微需氧条件(5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气)。
2.11 显微镜:10×~1000×。
2.12 低温高速离心机:8000g~20000g,4℃。
2.13 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.14 实时荧光PCR仪。
2.15 实时荧光PCR反应管。
2.16 微量移液器及吸头:0.1μL~2.5μL、0.5μL~10μL、2μL~20μL、20μL~200μL、100μL~
1000μL。
2.17 无菌离心管:50mL、100mL或更大容量。
2.18 螺口管:10mL。
2.19 无菌接种环:1μL、10μL。
2.20 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
2.21 微生物生化鉴定系统。
2.22 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOFMS)。
3 培养基和试剂
3.1 0.1%蛋白胨水:见附录A中A.1。
3.2 无菌生理盐水:见A.2。
3.3 弯曲菌增菌液:见A.3。
3.4 哥伦比亚血琼脂(Columbiabloodagar):见A.4。
3.5 卡玛丽血琼脂(Karmalibloodagar):见A.5。
3.6 氧化酶试剂:见A.6。
3.7 3%过氧化氢(H2O2)溶液:见A.7。
3.8 吲哚乙酸酯纸片:见A.8。
3.9 1mol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液:见A.9。
3.10 马尿酸钠水解试剂:见A.10。
3.11 微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统试剂。
3.12 实时荧光PCR检测试剂盒或检测试剂(2×实时荧光PCR缓冲溶液、dNTPs、TaqDNA聚合酶
和灭菌去离子水)。
3.13 空肠弯曲菌参比菌株[NPRC(S)01.13897]或其他等效菌株。
3.14 结肠弯曲菌参比菌株[NPRC(S)01.13898]或其他等效菌株。
3.16 海鸥弯曲菌(Campylobacterlari)参比菌株[NPRC(S)01.13900]或其他等效菌株。
4 检验程序
空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验程序见图1。
图1 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌检验程序
5 操作步骤
5.1 样品处理
5.1.1 一般样品
取25g(mL)样品[水果、蔬菜、水产品(贝类除外)取50g]加至装有100mL无菌0.1%蛋白胨水的
有滤网的均质袋中,用拍击式均质器均质1min~2min(或者充分揉搓、振荡5min~10min)后经滤网
过滤至离心管中,滤过液以12000g4℃离心15min后弃去上清(可多次离心富集),用1mL无菌生理
盐水重悬沉淀,取1mL的悬浮液加至盛有9mL弯曲菌增菌液中增菌培养。
5.1.2 整禽等样品
用200mL~400mL无菌0.1%蛋白胨水充分揉搓样品内外部,振荡5min~10min后用无菌纱布
或通过有滤网的均质袋过滤至离心管中,滤过液以12000g4℃离心15min后弃去上清(可多次离心
富集),用1mL的无菌生理盐水重悬沉淀,取1mL的悬浮液加至盛有9mL弯曲菌增菌液中增菌
培养。
5.1.3 贝类(已去壳)
取100g~200g样品放入无菌均质袋中,用拍击式均质器均质1min~2min,取25g内容物加至
盛有100mL无菌0.1%蛋白胨水的有滤网均质袋中,用拍击式均质器均质1min~2min(或者充分振
荡5min~10min)后经滤网过滤至离心管中,滤过液以12000g4℃离心15min后弃去上清(可多次
离心富集),用1mL无菌生理盐水重悬沉淀,取1mL的悬浮液加至盛有9mL弯曲菌增菌液中增菌
培养。
5.1.4 液态蛋清或全蛋混合物
取25g(mL)样品于75mL无菌0.1%蛋白胨水中,充分混匀样品,将样品移至离心管中,20000g4℃
离心15min后弃去上清(可多次离心富集),用1mL无菌生理盐水重悬沉淀,取1mL的悬浮液加至盛
有9mL弯曲菌增菌液中增菌培养。
5.1.5 鲜乳和其他乳制品
若为液体乳制品,直接取50g;若为固体乳制品,切碎后取50g加至盛有100mL的无菌0.1%蛋白
胨水的有滤网均质袋中,用拍击式均质器均质15s~30s后经滤网过滤至离心管中。将液体乳制品或
滤过液以20000g4℃离心30min后弃去上清(可多次离心富集),用1mL无菌生理盐水重悬沉淀(避
免带入脂质层),取1mL的沉淀悬浮液加至9mL的弯曲菌增菌液中增菌培养。
5.1.6 需表面涂拭检测的样品
用无菌生理盐水浸湿的无菌拭子擦拭检测样品的表面(面积至少100cm2),将拭子头剪落至盛有
9mL的弯曲菌增菌液中增菌培养。
5.1.7 水样
将4L的水(对于氯处理的水,离心前每升水中加入5mL浓度为1mol/L的硫代硫酸钠溶液),
12000g4℃离心30min后弃去上清(可多次离心富集),用1mL无菌生理盐水重悬沉淀,取1mL沉
淀悬浮液加至盛有9mL的弯曲菌增菌液中增菌培养。
5.2 增菌
松开装有增菌液的螺口管管口,微需氧条件下,42℃±1℃培养24h±2h。
5.3 分离
5.3.1 贴膜
哥伦比亚血琼脂平板和卡玛丽血琼脂平板平衡至室温后,用无菌镊子沿边缘部分夹取0.45μm的
无菌滤膜,分别贴在两种平板表面(在平板中央部位),使滤膜与培养基表面充分贴合。
5.3.2 加样
取300μL的增菌液,分成4次~6次(滴成4滴~6滴,液滴尽量不要融合)滴加于滤膜表面(液滴
位置要在滤膜边缘内),静置等待滤膜上的液滴充分透过滤膜(静置45min~60min,微需氧或普通气
体环境),无菌操作,揭掉滤膜。将平板翻转,微需氧条件下,42℃±1℃培养24h~48h。
5.3.3 观察
培养24h~48h后,观察两种平板上的菌落形态。卡玛丽血琼脂平板上的可疑菌落通常为淡灰
色、不溶血、表面湿润有金属光泽;哥伦比亚血琼脂平板上的可疑菌落通常为灰白色、不溶血、表面湿润
有光泽。两种血琼脂平板上的可疑菌落都可呈现分散凸起的菌落,边缘整齐、发亮。若48h培养后细
菌生长缓慢或菌落很小,可延长培养时间至72h,若培养48h后无疑似菌落生长则判定结果为阴性。
5.4 鉴定
5.4.1 弯曲菌属的鉴定
5.4.1.1 纯培养
挑取至少5个可疑菌落(少于5个全部挑取),分别接种至哥伦比亚血琼脂平板上进行单菌落纯培
养,微需氧条件,42℃±1℃培养24h~48h。按照5.4.1.2~5.4.1.4进行鉴定,结果符合表1的可疑菌
落鉴定为弯曲菌属。
5.4.1.2 形态观察
挑取可疑菌落进行革兰氏染色,镜检。
5.4.1.3 氧化酶试验
挑取可疑菌落(不可使用含铁接种环)至氧化酶试剂润湿的滤纸上,如果在10s内出现紫红色、紫
罗兰或深蓝色判定结果为阳性。
5.4.1.4 有氧条件下25℃±1℃生长试验
挑取可疑菌落,接种至哥伦比亚血琼脂平板上,有氧条件下25℃±1℃培养48h,观察细菌生长情况。
表1 弯曲菌属鉴定
项目 弯曲菌属特性
形态观察 革兰氏阴性,菌体可呈S形、螺旋状或海鸥展翅状a
氧化酶试验 阳性
有氧条件下25℃±1℃生长试验 不生长
a 有些菌株形态不典型。
5.4.2 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的鉴定
对于5.4.1中弯曲菌属的可疑菌落,可通过生化试验或者实时荧光PCR或者基质辅助激光解吸电
离飞行时间质谱的方法进行空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的鉴定。
5.4.2.1 生化试验
5.4.2.1.1 过氧化氢酶试验
挑取单菌落纯培养物,加至干净玻片上的3%过氧化氢溶液中,如果在30s内出现气泡则判定结果
为阳性。
5.4.2.1.2 马尿酸钠水解试验
挑取单菌落纯培养物,加至盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后36℃±1℃
水浴或金属浴2h或36℃±1℃恒温培养箱温育4h(期间可取出混匀)。沿着试管壁缓缓加入0.2mL
茚三酮溶液(期间不可摇晃或者振荡试管),在36℃±1℃的水浴或金属浴中再温育10min后判读结
果。若出现深紫色则判定结果为阳性;若出现淡紫色或无颜色变化则判定结果为阴性。
5.4.2.1.3 吲哚乙酸酯水解试验
挑取单菌落纯培养物,加至吲哚乙酸酯纸片上,再滴加一滴无菌水。如果吲哚乙酸酯水解,则在
5min~10min内出现深蓝色,判定结果为阳性;若无颜色变化则表示未发生水解,判定结果为阴性。
鉴定结果见表2。
表2 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的鉴定
菌种 过氧化氢酶试验 马尿酸钠水解试验 吲哚乙酸酯水解试验
空肠弯曲菌(C.jejuni) + + +
结肠弯曲菌(C.coli) + - +
海鸥弯曲菌(C.lari) + - -
乌普萨拉弯曲菌(C.upsaliensis) - - +
注:“+”表示阳性;“-”表示阴性。
5.4.2.1.4 生化鉴定替代试验
对于5.4.1中弯曲菌属的可疑菌落,可使用微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统等代替
5.4.2.1.1~5.4.2.1.3进行鉴定。
5.4.2.2 实时荧光PCR
5.4.2.2.1 试验环境与过程控制
PCR试验环境条件和过程控制应按GB/T 27403规定的要求执行。
5.4.2.2.2 DNA模板制备
挑取5.4.1中弯曲菌属可疑菌落的纯培养物加入盛有500μL去离子水的离心管中,水浴或者金属
浴100℃保持10min,随后取出于室温冷却2min,8000g~13000g离心10min,吸取上清液至新的无
菌离心管内,作为DNA模板使用。提取后的DNA模板应置于4℃供当天使用,否则应于-20℃以下
保存,并于1周内使用。
注:也可用细菌基因组提取试剂盒按说明书制备DNA模板。
5.4.2.2.3 引物及探针
引物及探针序列见表3。
表3 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌实时荧光PCR鉴定检测引物及探针信息
菌种 目标基因 引物和探针名称 引物和探针序列(5'-3')
空肠弯曲菌
(C.jejuni)
cj0415
表3 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌实时荧光PCR鉴定检测引物及探针信息 (续)
菌种 目标基因 引物和探针名称 引物和探针序列(5'-3')
结肠弯曲菌
(C.coli)
zupT
(50bp-160bp)
上游引物(CCF) TGACCATCCTTGCCGGAC
探针(CCP) VIC-CGCTATTGGTTCTGTGATA-MGB
a 序列中兼并碱基R为A或G。
5.4.2.2.4 实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表4,如用等效商品化实时荧光PCR检测试剂盒或检测试剂则按照对
应说明书进行操作。
表4 空肠弯曲菌和结肠弯曲菌实时荧光PCR反应体系
试剂 工作液浓度 加入量/μL
2×实时荧光PCR缓冲溶液 - 12.5
dNTPs 0.2mmol/L 0.5
TaqDNA聚合酶 0.25U/μL 0.5
空肠弯曲菌上游引物(CJF) 0.2μmol/L 0.5
空肠弯曲菌下游引物(CJR) 0.2μmol/L 0.5
空肠弯曲菌探针(CJP) 0.4μmol/L 0.5
结肠弯曲菌上游引物(CCF) 0.2μmol/L 0.5
结肠弯曲菌下游引物(CCR) 0.2μmol/L 0.5
结肠弯曲菌探针(CCP) 0.4μmol/L 0.5
DNA模板(10ng~100ng) - 1.0
灭菌去离子水(Nuclease-free) - 7.5
总体积 - 25.0
5.4.2.2.5 实时荧光PCR反应程序
预变性:94℃、30s;变性:94℃、5s,退火延伸:60℃、30s,40个循环。分别以荧光基团FAM(或
者VIC/HEX/CY5)标记空肠弯曲菌的探针CJP、以荧光基团VIC(或者FAM/CY5/HEX)标记结肠弯
曲菌的探针CCP,在60℃延伸阶段采集荧光信号。
5.4.2.2.6 实时荧光PCR对照设置
PCR反应使用空肠弯曲菌参比菌株和结肠弯曲菌参比菌株的DNA模板作为阳性对照,使用海鸥
弯曲菌参比菌株和乌普萨拉弯曲菌参比菌株的DNA模板作为阴性对照,以灭菌去离子水作为空白
对照。
5.4.2.2.7 实时荧光PCR结果判定
5.4.2.2.7.1 结果有效性原则
同一次实验中需同时满足下列要求,则实时荧光PCR实验结果有效;否则实时荧光PCR实验结果
无效,需重新进行实验:
a) 空白对照:无荧光对数增长,相应的Ct值 >40.0(或者无Ct值);
b) 阴性对照:无荧光对数增长,相应的Ct值 >40.0(或者无Ct值);
c) 阳性对照:空肠弯曲菌的cj0415基因和结肠弯曲菌的zupT 基因均有荧光对数增长,且荧光
通道出现典型的扩增曲线,相应的Ct值< 30.0。
5.4.2.2.7.2 实时荧光PCR结果判定
在符合实验结果有效性的原则下,若:
a) 检测基因的Ct值< 30.0,则判定为该基因阳性;
b) 检测基因的Ct值≥40.0,则判定为该基因阴性;
c) 检测基因的Ct值≥30.0且< 40.0,应重新进行实时荧光PCR扩增实验。再次扩增后Ct值<
40.0,有典型的扩增曲线,且对照实验结果均正常,则可判定为该基因阳性。
5.4.2.3 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定
对于5.4.1中弯曲菌属可疑菌落也可选用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行鉴定。
6 结果与报告
依据5.4.2.1或5.4.2.2或5.4.2.3实验结果,报告检样单位中检出或未检出空肠弯曲菌和/或结肠
弯曲菌。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 0.1%蛋白胨水
A.1.1 成分
蛋白胨 1.0g
蒸馏水 1000.0mL
pH 7.1±0.2(25℃)
A.1.2 制法
将蛋白胨溶解于蒸馏水中,校正pH使培养基灭菌后冷却至25℃时为7.1±0.2,121℃灭菌15min
备用。
A.2 无菌生理盐水
A.2.1 成分
NaCl 8.5g
蒸馏水 1000.0mL
A.2.2 制法
称取8.5g氯化钠溶解于1000.0mL蒸馏水中,121℃灭菌15min备用。
A.3 弯曲菌增菌液
A.3.1 基础培养基
A.3.1.1 成分
牛脑浸粉 12.5g
牛心浸粉 5.0g
蛋白胨 10.0g
葡萄糖 4.0g
磷酸二氢钠 2.5g
氯化钠 5.0g
丙酮酸钠 0.25g
焦亚硫酸钠 0.25g
硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 0.25g
蒸馏水 1000.0mL
pH 7.1±0.2(25℃)
A.3.1.2 制法
将A.3.1.1中的各种成分混匀,加热煮沸至完全溶解,校正pH使培养基灭菌后冷却至25℃时为
7.1±0.2,121℃灭菌15min备用。
A.3.2 无菌脱纤维绵羊血
无菌操作条件下,将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中,振摇约10min,静置后除去附有血纤维
的玻璃珠即可。
A.3.3 抗生素溶液
A.3.3.1 成分
万古霉素(vancomycin) 0.02g
三甲氧苄胺嘧啶(trimethoprim) 0.015g
两性霉素B(amphotercinB) 0.015g
利福平(rifampicin) 0.01g
头孢哌酮(cefoperazone) 0.03g
乙醇/灭菌水(50/50,体积比) 4.0mL
A.3.3.2 制法
将A.3.3.1中各成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。
A.3.4 完全培养基
A.3.4.1 成分
基础培养基 1000.0mL
无菌脱纤维绵羊血 50.0mL
抗生素溶液 4.0mL
A.3.4.2 制法
当基础培养基的温度约为50℃时,无菌操作,加入5.0mL的绵羊血和4.0mL的抗生素溶液,混
匀。按照9.0mL每份分装入螺口管备用,2℃~8℃避光保存不得超过7d。
A.4 哥伦比亚血琼脂(Columbiabloodagar)
胰酪胨或胰蛋白胨 10.0g
牛心浸粉 3.0g
蛋白胨 5.0g
酵母浸粉 5.0g
玉米淀粉 1.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 13.0g~15.0g
蒸馏水 1000.0mL
pH 7.3±0.2(25℃)
A.4.1.2 制法
将A.4.1.1成分溶于蒸馏水中,校正pH 使培养基灭菌后冷却至25℃为7.3±0.2。121℃灭菌
15min,备用。
A.4.2 无菌脱纤维绵羊血
无菌操作条件下,将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中,振摇约10min,静置后除去附有血纤维
的玻璃珠即可。
A.4.3 完全培养基
A.4.3.1 成分
基础培养基 1000.0mL
无菌脱纤维绵羊血 50.0mL
A.4.3.2 制法
当基础培养基的温度为50℃左右时,无菌加入绵羊血,混匀。倾注15mL~20mL完全培养基于
无菌90mm平皿中或者12mL~13mL完全培养基于无菌60mm平皿中,静置至培养基凝固。制备
的平板未干燥时在室温放置不得超过4h,或在2℃~8℃冷藏不得超过7d。
A.5 卡玛丽血琼脂(Karmalibloodagar)
哥伦比亚琼脂基础 39.0g
活性炭 4.0g
氯化血红素 0.032g
蒸馏水 1000.0mL
pH 7.1±0.2(25℃)
A.5.1.2 制法
将A.5.1.1成分溶于蒸馏水中,校正pH 使培养基灭菌后冷却至25℃为7.1±0.2。121℃灭菌
15min,备用。
A.5.2 无菌脱纤维绵羊血
无菌操作条件下,将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中,振摇约10min,静置后除去附有血纤维
的玻璃珠即可。
A.5.3 完全培养基
A.5.3.1 成分
基础培养基 1000.0mL
无菌脱纤维绵羊血 50.0mL
A.5.3.2 制法
当基础培养基的温度为50℃左右时,无菌加入绵羊血,混匀。倾注15mL~20mL完全培养基于
无菌90mm平皿中或12mL~13mL完全培养基于无菌60mm平皿中,静置至培养基凝固。制备的平
板未干燥时在室温放置不得超过4h,或在2℃~8℃冷藏不得超过7d。
A.6 氧化酶试剂
A.6.1 成分
四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g
蒸馏水 100.0mL
A.6.2 制法
使用前将A.6.1中各成分溶于蒸馏水中。
A.7 3%过氧化氢(H2O2)溶液
A.7.1 成分
30%过氧化氢(H2O2)溶液 100.0mL
蒸馏水 900.0mL
A.7.2 制法
吸取100.0mL30%过氧化氢(H2O2)溶液,溶于900.0mL蒸馏水中,混匀,分装备用。
A.8 吲哚......
|