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| 标准编号 | GB 5009.299-2024 (GB5009.299-2024) | | 中文名称 | 食品安全国家标准--食品中乳铁蛋白的测定 | | 英文名称 | National food safety standards--Determination of lactoferrin in food | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 8,898 | | 发布日期 | 2/8/2024 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局 | GB 5009.299-2024: 食品安全国家标准--食品中乳铁蛋白的测定
GB 5009.299-2024 英文版: National food safety standards--Determination of lactoferrin in food
中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准
食品安全国家标准
食品中乳铁蛋白的测定
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
食品安全国家标准
食品中乳铁蛋白的测定
1 范围
本标准规定了食品中乳铁蛋白的高效液相色谱测定方法。
本标准适用于巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料、调制乳粉及乳基婴幼儿配方食品中牛乳铁蛋白含量
的测定。
本标准不适用于风味发酵乳、豆基婴幼儿配方食品中牛乳铁蛋白的测定。
2 原理
试样中的牛乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取,肝素亲和柱富集净化后,反相高效液相色谱柱分离,紫
外检测器于280nm处检测,外标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。
3.1.2 三氟乙酸(CF3CO2H):色谱纯。
3.1.3 氯化钠(NaCl)。
3.1.4 磷酸(H3PO4)。
3.1.5 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
3.2 试剂配制
3.2.1 磷酸盐缓冲液Ⅰ:称取7.1g磷酸氢二钠、58.4g氯化钠,加900mL水溶解,用磷酸调pH至8.0
±0.2,加水定容至1000mL,临用现配。
3.2.2 磷酸盐缓冲液Ⅱ:称取28.4g磷酸氢二钠,加900mL水溶解,用磷酸调pH至7.5±0.2,加水定
容至1000mL,临用现配。
3.2.3 0.1%三氟乙酸溶液:量取1mL三氟乙酸注入900mL水中,用水稀释至1000mL,过0.45μm
滤膜。
3.3 标准品
牛乳铁蛋白标准品(CAS号:146897-68-9):纯度≥95%,铁含量≤35mg/100g,或经国家认证并授
予标准物质证书的标准品。
注:标准品可以使用满足溯源要求的商品化标准溶液。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 牛乳铁蛋白标准储备溶液(5.0mg/mL):称取50mg(精确至0.1mg)牛乳铁蛋白标准品用水溶
解,转移至10mL容量瓶并定容至刻度,混匀,0℃~4℃条件下保存,可保存3个月。
3.4.2 牛乳铁蛋白标准中间溶液(0.50mg/mL):吸取1.0mL牛乳铁蛋白标准储备溶液,用磷酸盐缓
冲液Ⅰ定容至10mL,临用现配。
3.4.3 牛乳铁蛋白标准系列工作溶液:准确移取上述牛乳铁蛋白标准中间溶液,用磷酸盐缓冲液Ⅰ稀
释定容,配制成浓度分别为1.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100.0μg/mL和
200.0μg/mL的标准系列工作液,临用现配。
3.5 材料
3.5.1 肝素亲和柱:1mL,柱容量≥2mg,或性能相当者(验证方法见附录B)。
注:使用不同厂商的肝素亲和柱,在样品提取、上样、淋洗和洗脱的操作方面可能会略有不同,应根据肝素亲和柱特
点进行优化。
3.5.2 滤膜,水相,0.45μm。
3.5.3 水相针头滤器:聚醚砜材质,0.45μm。
4 仪器和设备
4.1 高效液相色谱仪:配有紫外检测器或相当者。
4.2 天平:感量分别为0.01g和0.1mg。
4.3 冷冻离心机:4℃,转速≥10000r/min。
4.4 pH计:精度为0.01。
4.5 涡旋振荡器。
4.6 恒温水浴锅。
4.7 固相萃取柱装置。
5 分析步骤
5.1 样品前处理
5.1.1 试样制备
取有代表性的样品至少200g,液态样品摇匀后储存于容器中作为试样,于0℃~4℃保存,备用;
固态样品混匀后储存于容器中作为试样,常温下干燥保存,备用。
5.1.2 试样提取
5.1.2.1 液态试样(巴氏杀菌乳、调制乳、含乳饮料)
称取5g(精确至0.01g)试样于烧杯中,加入适量磷酸盐缓冲液Ⅱ提取,分次将样品转移至25mL
容量瓶,用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度,充分混匀后转入离心管,在4℃条件下10000r/min离心
8min,取样液待净化。
5.1.2.2 固态试样(调制乳粉、乳基婴幼儿配方食品)
称取1g~5g(精确至0.01g)试样于烧杯中,加入温热(温度不超过50℃)的磷酸盐缓冲液Ⅱ,搅
拌使样品溶解,冷却至室温,分次将样品转移至50mL容量瓶并用磷酸盐缓冲液Ⅱ定容至刻度,充分混
匀后转入离心管中,取40.0mL溶液在4℃条件下10000r/min离心8min,取样液待净化。
5.1.3 试样净化
肝素亲和柱使用前先加入5.0mL磷酸盐缓冲液Ⅱ活化。准确移取10.0mL上述样液过柱,控制
流速在1mL/min~3mL/min,待样液滴完后,用10.0mL磷酸盐缓冲液Ⅱ淋洗,弃去流出液;再用
5.0mL磷酸盐缓冲液Ⅰ洗脱,收集洗脱液并用磷酸盐缓冲液Ⅰ定容至5.00mL,过0.45μm水相针头滤
器,供上机检测分析用。
注:在样品过柱前,可根据实际样品中乳铁蛋白含量调整具体上样液体积。
5.2 仪器参考条件
5.2.1 色谱柱:C4,5μm,300Å,250mm×4.6mm(内径)或相当者。
5.2.2 检测波长:280nm。
5.2.3 柱温:30℃。
5.2.4 进样体积:50μL。
5.2.5 流速:1.0mL/min。
5.2.6 流动相:0.1%三氟乙酸溶液和乙腈,梯度洗脱参数见表1。
5.3 标准曲线的制作
将牛乳铁蛋白标准系列工作溶液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以标准工作液中
牛乳铁蛋白的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。牛乳铁蛋白标准溶液的色谱图见附录
A中图A.1。
5.4 试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪中,得到峰面积,根据标准曲线得到试样中牛乳铁......
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