[PDF] GB/T 15670.16-2017 - 自动发货. 英文版
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| GB/T 15670.16-2017 | 170 | GB/T 15670.16-2017 | 9秒内发货PDF | 农药登记毒理学试验方法 第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | GB/T 15670.16-2017 (GB/T15670.16-2017) |
| 中文名称 | 农药登记毒理学试验方法 第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 |
| 英文名称 | Toxicological Test Methods for Pesticides Registration - Part 16: In Vivo Mammalian Bone Marrow Cell Chromosome Aberration Test |
| 行业 | 国家标准 (推荐) |
| 中标分类 | B17 |
| 国际标准分类 | 65.100 |
| 字数估计 | 9,939 |
| 发布日期 | 2017-07-12 |
| 实施日期 | 2018-02-01 |
| 旧标准 (被替代) | GB/T 15670-1995 Partly |
| 引用标准 | GB 14925 |
| 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 |
| 范围 | GB/T 15670的本部分规定了体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求。本部分适用于为农药登记而进行的体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验。 |
GB/T 15670.16-2017: 农药登记毒理学试验方法 第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
GB/T 15670.16-2017 英文名称: Toxicological test methods for pesticides registration -- Part 16: In vivo mammalian bone marrow cell chromosome aberration test
ICS 65.100
B17
中华人民共和国国家标准
部分代替GB/T 15670-1995
2017-07-12发布
2018-02-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会发布
前言
GB/T 15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分:
---第1部分:总则;
---第2部分:急性经口毒性试验 霍恩氏法;
---第3部分:急性经口毒性试验 序贯法;
---第4部分:急性经口毒性试验 概率单位法;
---第5部分:急性经皮毒性试验;
---第6部分:急性吸入毒性试验;
---第7部分:皮肤刺激性/腐蚀性试验;
---第8部分:急性眼刺激性/腐蚀性试验;
---第9部分:皮肤变态反应(致敏)试验;
---第10部分:短期重复经口染毒(28天)毒性试验;
---第11部分:短期重复经皮染毒(28天)毒性试验;
---第12部分:短期重复吸入染毒(28天)毒性试验;
---第13部分:亚慢性毒性试验;
---第14部分:细菌回复突变试验;
---第15部分:体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验;
---第16部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验;
---第17部分:哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验;
---第18部分:啮齿类动物显性致死试验;
---第19部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;
---第20部分:体外哺乳动物细胞基因突变试验;
---第21部分:体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成(UDS)试验;
---第22部分:体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验;
---第23部分:致畸试验;
---第24部分:两代繁殖毒性试验;
---第25部分:急性迟发性神经毒性试验;
---第26部分:慢性毒性试验;
---第27部分:致癌试验;
---第28部分:慢性毒性与致癌合并试验;
---第29部分:代谢和毒物动力学试验。
本部分为GB/T 15670的第16部分。
本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本部分部分代替GB/T 15670-1995《农药登记毒理学试验方法》。
本部分与GB/T 15670-1995的哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验部分相比主要变化如下:
---修改和调整了标准的总体结构和编排格式;
---增加了一些章节内容(见第1章、第2章、第3章、第4章、第5章、6.1和第8章);
---修改了对实验动物的要求(见6.2,1995年版的14.5.1);
---修改了剂量和分组的内容(见6.3,1995年版的14.5.2);
---修改了染毒方式内容(见6.4,1995年版的14.5.3);
---修改了阅片的内容(见6.7,1995年版的14.5.5)。
本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。
本部分起草单位:农业部农药检定所。
本部分主要起草人:肖杭、环飞、张丽英、陶传江。
本部分所代替标准的历次版本发布情况为:---GB/T 15670-1995。
农药登记毒理学试验方法
第16部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体
畸变试验
1 范围
GB/T 15670的本部分规定了体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求。
本部分适用于为农药登记而进行的体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 14925 实验动物 环境及设施
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
染色单体型畸变 染色体结构损伤,表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。
3.2
染色体型畸变 染色体结构损伤,表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。
3.3
内复制 在DNA复制的S期后,细胞核并不进入有丝分裂期,而开始另一个S期的过程。其结果是染色体
含4、8、16个染色单体。
3.4
裂隙 染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度,为染色单体的最小的错误排列。
3.5
染色体数目畸变 染色体数目改变,不同于所用细胞染色体的正常数目。
3.6
多倍体
哺乳动物细胞染色体数目正常为二倍体,在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加,如三倍体、四倍体等。
3.7
染色体结构畸变 通过显微镜观察到的细胞分裂中期相的结构改变,如染色体缺失、染色体互换和内交换等。
4 试验目的 检测受试物是否引起哺乳动物骨髓细胞染色体畸变,以评价受试物致突变的可能性。
5 试验概述
染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体,当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时,
诱发染色体型畸变,而作用于G2期时则诱发染色单体型畸变。给试验的大、小鼠腹腔注入秋水仙素,
抑制细胞分裂时纺锤丝的形成,以增加中期分裂相细胞的比例,并使染色体丝缩短、分散、轮廓清晰。在
显微镜下观察染色体数目和形态。本方法特别适用于需考虑体内代谢活化后的染色体畸变分析。若有
证据表明受试物或其代谢产物不能到达骨髓,则不适用于本方法。
6 试验方法
6.1 受试物和仪器试剂
6.1.1 受试物
首选蒸馏水作溶剂,如受试物不溶于水,可用食用油、食用淀粉、0.5%羧甲基纤维素钠配成乳浊液
或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制,除非有资料表明以溶液(或乳浊液、悬浊液)保存具有稳定性。
如不是常用溶剂,应有参考资料并说明其成分及选做溶剂的原因。
6.1.2 仪器及试剂
6.2 实验动物
6.2.1 动物选择
推荐使用大鼠、小鼠和中国仓鼠,其他合适的哺乳动物也可选用。应使用健康初成年动物,如使用
小鼠,周龄7周~12周为最好。在试验开始时,动物体重差异应不超过同性别平均体重的±20%。动
物要随机分配到对照组和受试物处理组,每个剂量组、每种性别、每个采样时间点至少5只动物能用于
分析。如果有资料证明两性别间毒性作用无差别,则可只用一种性别的动物做试验。
6.2.2 饲养环境
试验前,动物应在饲养环境中检疫、适应3d~5d。实验动物饲养环境应符合GB 14925的有关规定。
6.3 剂量与分组
6.3.1 剂量设计原则
如果没有适当的资料,应进行预试验来确定剂量范围。预试验所在的实验室、所用动物种属、品系、
性别以及染毒方式应与正式试验相同。如果受试物存在毒性,应在第一个采样时间点设3个剂量,剂量
范围应包括从最大毒性至最小毒性或无毒性剂量。第二个采样时间点仅需设置高剂量。高剂量是能使
受试动物出现严重中毒反应的剂量,高于此剂量将会引起动物死亡。低剂量不应出现毒性反应。中、低
剂量按等比级数设置,一般高、中、低剂量可分别采用1/2LD50、1/4LD50、1/8LD50。
对有特异生物学活性的受试物(如激素和促细胞分裂剂)可应用其他剂量设置原则。高剂量也可采
用能在骨髓中产生明显毒性的剂量(如抑制骨髓细胞有丝分裂指数达50%以上)。
6.3.2 限量试验
如果单次染毒(或同一天2次染毒)剂量在2000mg/kg体重以上,仍不产生可观察到的毒性效应,
并且根据结构相关化合物的资料预期无遗传毒性,则不需要进行3个剂量水平的试验。染毒时间在
14d内的,剂量设为2000mg/kg体重;染毒时间长于14d的,剂量设为1000mg/kg体重。如果人类
的可能(期望)暴露量过大,限量试验应以5000mg/kg体重剂量水平进行或选择更高的剂量。
6.3.3 对照组设定
6.3.3.1 每次试验每一性别都应设置相应的阳性和阴性对照(溶剂/载体),除不用受试物染毒之外,对
照组动物应与染毒组动物以相同方式进行操作。
6.3.3.2 阳性对照组应预期可检测到超过本底值的体内染色体结构畸变的增加,以证实试验系统敏感
性。阳性对照的染毒途径可不同于受试物染毒途径,并且仅于单个时间点采样。最好使用与受试物化
学结构相关的阳性对照,常用阳性对照物参见附录A。
6.3.3.3 阴性对照为溶剂对照。依据动物间的变异和染色体畸变细胞频率的本底对照资料,判断是否
在每个采样时间点均设置阴性对照组,并与染毒组同样的方式处置。如果阴性对照采用单次采样,则最
适宜采样时间为首次采样时间。如果没有历史对照资料证明所用溶剂无细胞毒性或无致突变作用,则
应增设空白对照。
6.4 染毒方式
6.4.1 常采用灌胃法染毒,阳性对照组也可采用腹腔注射的方法。推荐受试物1次染毒。给样量较大
的受试物,也可分次染毒,如在同一天中间隔不超过6h,2次染毒。首次采集样品时间推荐在末次染毒
后12h~18h(正常细胞周期的1.5倍),第二次采集样品时间推荐为第一次采样时间后24h。
6.4.2 其他的染毒方式应说明理由。如果染毒超过一天,可采取末次染毒后12h~18h(正常细胞周期
的1.5倍)一次采样。
6.5 染色体制备
6.5.1 大鼠在处死前4h,腹腔注射秋水仙素(4mg/kg体重)。小鼠约间隔3h~5h,中国仓鼠约间隔4h~5h。
6.5.2 处死动物,迅速取出股骨,剔去肌肉,去除血污,剪去两端的骨骺,用带针头的注射器吸取生理盐
水或2.2%柠檬酸钠溶液,插入骨髓腔内,将骨髓冲洗入10mL离心管,然后用吸管吹打骨髓团块使其
均匀,以1000r/min速度离心10min,用滴管吸去上清液。
6.5.3 低渗:加入0.075mol/L氯化钾溶液9mL,用滴管将细胞轻轻地混匀,37℃低渗20min。
6.5.4 预固定:立即加入固定液1mL,混匀,以1000r/min速度离心10min,用滴管吸去上清液。
6.5.5 固定:加入7mL固定液,混匀,固定10min,以1000r/min速度离心10min,用滴管吸去上清
液。用同法再固定2次。
6.5.6 加入0.1mL~0.5mL新鲜固定液,用细口滴管充分混匀。
6.5.7 在洁净的冷冻玻片上方3cm~5cm处滴3滴~4滴细胞悬液于玻片上,轻吹细胞悬液扩散平铺
于玻片上,将玻片在酒精灯上微热烘烤,空气中自然干燥。每个标本制2张~3张。
6.6 染色
用新鲜配制的姬姆萨(Giemsa)应用液染色10min~15min,立即用磷酸盐缓冲液冲洗,晾干,写好
标签,阴凉干燥处保存。
6.7 阅片
6.7.1 确定有丝分裂指数:包括所有染毒组、阴性对照组和阳性对照组(每只动物分析1000个细胞),
以确定细胞毒性。
6.7.2 每个动物应至少分析100个分散良好的中期分裂相细胞,如畸变率很高,观察细胞数可减少。
由于制片方法常导致有染色体丢失的中期相的比例改变,所计数的细胞含染色体数应控制在2n±2。
6.7.3 观察项目包括:
a) 染色体数目的改变:非整倍体、多倍体、内复制;
b) 染色体结构的改变:断裂、微小体、有着丝点环、无着丝点环、单体互换、双微小体、非特定性型
变化(如粉碎化、着丝点细长化、粘着)等。
7 试验结果和评价
7.1 试验结果
以表格表示各个动物的资料。试验单位是每只动物,对每只动物应评价计数的细胞数,每个细胞的
畸变数和有染色体结构畸变的细胞百分率。应列表给出在染毒组和对照组不同类型的染色体结构畸变
数目和频率。应另外计数并报告裂隙,但一般不计入总畸变频率。如果没有性别差异的证据,雌雄动物
的数据可合并进行统计学分析。统计学处理可用χ2 检验,也可采用Fisher检验等统计方法。
7.2 试验结果的评价
7.2.1 判断阳性结果的标准为:染毒组与阴性对照组相比,染色体畸变率增加有统计学意义并有明显
的剂量-反应关系时,即可确认为阳性结果。若统计学差异有显著性,但无剂量-反应关系,则应进行重
复试验,差异能重复者可确定为阳性。评价时应从生物学意义与统计学意义两方面进行分析。
7.2.2 结果不符合上述标准的受试物可认为在本试验系统中为阴性结果。
7.2.3 多倍体增加表明受试物可诱导染色体数目畸变。内复制增加表明受试物可抑制细胞周期进展。
8 试验报告
试验报告应至少包括下列内容:
a) 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号;
b) 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况;
c) 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;
d) 试验摘要;
e) 受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAS号)(如已知)、代码(如有)、......
英文网页English: GB/T 15670.16-2017
相关标准: GB/T 15670.10|GB/T 15670.14|GB/T 15670.13|GB/T 15670.12|GB/T 15670.16-2017|GB/T 15670.16|