标准搜索结果: 'GB/T 17818-2025'
| 标准编号 | GB/T 17818-2025 (GB/T17818-2025) | | 中文名称 | 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法 | | 英文名称 | Determination of vitamin D3 in feeds - High-performance liquid chromatography | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B46 | | 国际标准分类 | 65.120 | | 字数估计 | 22,266 | | 发布日期 | 2025-01-24 | | 实施日期 | 2025-08-01 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 17818-2025: 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法
ICS 65.120
CCSB46
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 17818-2010
饲料中维生素D3的测定
高效液相色谱法
2025-01-24发布
2025-08-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替GB/T 17818-2010《饲料中维生素D3 的测定 高效液相色谱法》。与GB/T 17818-
2010相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
a) 更改了适用范围,增加了精料补充料,更改了“第一法 皂化提取法”定量限(见第1章,2010
年版的第1章);
b) 更改了“第二法 直接提取法”定量限(见第1章,2010年版的第1章);
c) 增加了“第一法 皂化提取法”维生素D3 标准系列溶液(见4.2.21);
d) 更改了“第一法 皂化提取法”中配合饲料、精料补充料、浓缩饲料样品制备方法为试样全部通
过1mm孔筛(见4.4,2010年版的3.5);
e) 更改了“第一法 皂化提取法”提取剂为“石油醚”(沸程30℃~60℃)(见4.5.1.2.1,2010年版
的3.6.1.2);
f) 增加了离线固相萃取法(见4.5.1.2.2)和在线固相萃取法(见4.5.1.2.3);
g) 增加了液相色谱参考条件(见4.5.2.2,4.5.2.3);
h) 增加了定性检测方法,定量检测增加多点校正(见4.5.2.5,4.5.2.6);
i) 删除了高效液相色谱净化柱净化(见2010年版的3.6.1.4);
j) 删除了高效液相色谱净化条件(见2010年版的3.6.2.1);
k) 删除了正相色谱(见2010年版的3.6.2.2.1);
l) 增加维生素D3 含量在100IU/kg~1000IU/kg范围时精密度要求(见4.7,2010年版的
3.6.2.5);
m) 更改了“第二法 直接提取法”,水浴温度不应超过65℃(见5.5.1,2010年版的4.6.1);
n) 增加了定性检测方法(见5.5.2.3)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。
本文件起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,山东省畜产品质量安全中
心,帝斯曼维生素(上海)有限公司,四川威尔检测技术股份有限公司,中牧实业股份有限公司,广州爱保
农生物科技有限公司。
本文件主要起草人:赵小阳、虞哲高、宋荣、张凤枰、朱高群、刘志英、汪忠艳、郭红双、马晓忠、张玮、
谢丽、宋艳、张辉、李丽蓓、陈学海、陈雪、崔婕、冯秀燕、曹林。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---1999年首次发布为GB/T 17818-1999,2010年第一次修订;
---本次为第二次修订。
饲料中维生素D3的测定
高效液相色谱法
1 范围
本文件描述了饲料中维生素D3 的高效液相色谱测定方法。
本文件中“第一法 皂化提取法”适用于配合饲料、精料补充料、浓缩饲料、复合预混合饲料中维生
素D3 的测定,“第二法 直接提取法”适用于维生素预混合饲料中维生素D3 的测定。
本文件第一法定量限为100IU/kg,第二法定量限为2.00×105IU/kg。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
3 术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4 第一法 皂化提取法
注意:分液漏斗活塞玻璃表面不涂油,处理过程在避光下操作;提取过程在通风柜中操作。
4.1 原理
试样用氢氧化钾乙醇溶液皂化,经液液萃取或固相萃取净化、浓缩后,用二维色谱系统分离,紫外检
测器检测,外标法定量。复合预混合饲料也可直接用反相色谱柱分离,紫外检测器检测,外标法定量。
4.2 试剂或材料
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。
4.2.1 水:GB/T 6682,一级。
4.2.2 无水乙醇:色谱纯。
4.2.3 无水乙醇。
4.2.4 石油醚(沸程30℃~60℃)。
4.2.5 甲醇:色谱纯。
4.2.6 乙腈:色谱纯。
4.2.7 甲酸:色谱纯。
4.2.8 异丙醇:色谱纯。
4.2.9 L-抗坏血酸。
4.2.10 二丁基羟基甲苯(BHT)。
4.2.11 无水硫酸钠。
4.2.12 氢氧化钾溶液(500g/L):称取500g氢氧化钾,加水溶解,冷却后用水定容至1L,混匀。
4.2.13 乙醇溶液Ⅰ(70%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)700mL,用水稀释,定容至1L,混匀。
4.2.14 乙醇溶液Ⅱ(50%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)500mL,用水稀释,定容至1L,混匀。
4.2.15 甲醇溶液(10%,体积分数):量取甲醇10mL,用水稀释,定容至100mL,混匀。
4.2.16 甲酸溶液(0.1%,体积分数):量取甲酸1mL,用水稀释,定容至1L,混匀。
4.2.17 乙醇溶液Ⅲ(40%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)400mL,用水稀释,定容至1L,混匀。
4.2.18 乙腈-异丙醇混合溶液:量取50mL乙腈(4.2.6)与50mL异丙醇(4.2.8)混合均匀。
4.2.19 维生素D3 标准储备液(40000IU/mL):称取50mg维生素D3(胆钙化醇)标准品(C27H44O,
CAS号:67-97-0,纯度≥99.0%,或标准物质/标准样品)(精确至0.00001g)于50mL棕色容量瓶中,用
无水乙醇(4.2.2)溶解并稀释至刻度,混匀,-20℃~-18℃避光保存,有效期为6个月。
注:1国际单位(IU)维生素D3 相当于0.025μg胆钙化醇。
4.2.20 维生素D3 标准中间溶液(1000IU/mL):准确移取维生素D3 标准储备液(4.2.19)0.25mL于
10mL棕色容量瓶中,用无水乙醇(4.2.2)稀释定容,混匀,临用现配。
4.2.21 维生素D3 标准系列溶液Ⅰ:准确吸取适量的维生素D3 标准中间溶液(4.2.20),于100mL棕
色容量瓶中,用无水乙醇(4.2.2)稀释并定容,混匀,配制成质量浓度分别为0.05IU/mL、0.1IU/mL、
0.2IU/mL、0.5IU/mL 、1.0IU/mL、5.0IU/mL、10.0IU/mL、20.0IU/mL 及 5.0IU/mL、
10.0IU/mL、20.0IU/mL、50.0IU/mL、100.0IU/mL标准系列溶液,临用现配。
4.2.22 维生素D3 标准系列溶液Ⅱ:准确吸取适量的维生素D3 标准中间溶液(4.2.20),于100mL棕
色容量瓶中,用乙醇溶液Ⅱ(4.2.14)稀释并定容,混匀,配制成质量浓度分别为0.06IU/mL、
0.12IU/mL、0.24IU/mL、0.4IU/mL、0.80IU/mL、1.6IU/mL、4.0IU/mL、8.0IU/mL、16IU/mL标
准系列溶液,临用现配。
4.2.23 酚酞指示剂(10g/L):称取1g酚酞,用95%乙醇溶解,并稀释至100mL,混匀。
4.2.24 固相萃取柱:填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物,200mg/6mL,或相当者。
4.2.25 在线固相萃取柱:填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物,长为12.5mm,内径为4.6mm,粒径为
15μm~20μm,或相当者。
4.2.26 微孔滤膜:孔径0.2μm,有机系。
4.2.27 氮气:纯度99.9%。
4.3 仪器和设备
4.3.1 高效液相色谱仪:配有紫外吸收检测器(或二极管矩阵检测器)。
4.3.2 二维液相色谱系统:配有1个紫外检测器(或二极管矩阵检测器)和1个高灵敏度紫外检测器(或
二极管矩阵检测器)。
4.3.3 在线固相萃取-二维液相色谱系统:在二维液相色谱的系统上增加1个泵和1个六通阀。
4.3.4 分析天平:精度为0.01g、0.001g、0.0001g和0.00001g。
4.3.5 回流装置:圆底烧瓶和冷凝管。
4.3.6 恒温水浴锅:控温精度±2℃。
4.3.7 旋转蒸发仪。
4.3.8 离心机:转速不低于10000r/min。
4.3.9 固相萃取装置。
4.3.10 氮吹仪:带加热装置,控温精度±2℃。
4.3.11 涡旋混合器。
4.4 样品
配合饲料、精料补充料、浓缩饲料试样,按照GB/T 20195规定制备试样,至少200g,粉碎使其全部
通过1mm孔径的试验筛,混合均匀,装入密闭容器中,2℃~8℃避光保存,尽快测定。复合预混合饲
料试样经缩分、混合均匀后装入密闭容器中,2℃~8℃避光保存,尽快测定。
4.5 试验步骤
4.5.1 试样溶液的制备
4.5.1.1 皂化
平行做两份试验。称取配合饲料、浓缩饲料、精料补充料5g~10g(精确至0.01g);称取复合预混
合饲料4g(精确至0.001g),置入250mL圆底烧瓶中,加1gL-抗坏血酸(4.2.9)、0.2gBHT
(4.2.10),加入50mL无水乙醇(4.2.3)和20mL氢氧化钾溶液(500g/L)(4.2.12)(在线固相萃取加
10mL),置于沸水浴上回流30min,不时振荡,防止试样粘附在瓶壁上,皂化结束,依次用5mL无水乙
醇(4.2.3)、5mL水自冷凝管顶端冲洗其内部,取出烧瓶,冷却至约40℃,备用。
4.5.1.2 提取净化
4.5.1.2.1 液液萃取法
将皂化液(4.5.1.1)全部转移至盛有100mL石油醚(4.2.4)的500mL分液漏斗中,用30mL~
50mL水分2次~3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗,再用5mL~10mL乙醇冲洗转移,加盖、混匀后放
气,激烈振荡2min,静置、分层。转移水相于另一个分液漏斗中,分次用100mL、60mL石油醚(4.2.4)
各提取1次,弃去水相,合并3次石油醚相。用水每次100mL洗涤石油醚提取液至中性[可用酚酞指
示剂(4.2.23)检测下层溶液,直至无色],初次水洗时轻轻旋摇,防止乳化。
配合饲料、精料补充料、浓缩饲料、复合预混合饲料的石油醚提取液经约3g无水硫酸钠(4.2.11)脱
水,转移到旋转蒸发仪烧瓶中,在水浴温度约50℃,一定真空条件下蒸发至干或用氮气吹至近干。残渣
用无水乙醇(4.2.3)溶解并稀释定容至10mL,于离心管中,5000r/min离心5min,或过0.2μm微孔滤
膜至进样瓶中,待测。
4.5.1.2.2 离线固相萃取法
将皂化液(4.5.1.1)全部转移至100mL棕色容量瓶中,用5mL乙醇溶液Ⅰ(4.2.13)洗涤瓶内的残
渣并将溶液并入容量瓶内,重复洗涤两次,用乙醇溶液Ⅰ(4.2.13)定容,混匀,取一定体积皂化液于离心
管中,5000r/min离心5min,上清液待用。
依次移取3mL甲醇、5mL水淋洗、活化固相萃取柱(4.2.24),弃去淋洗液。对于配合饲料、精料补
充料和浓缩饲料,上清液混匀后准确移取6mL于15mL具塞离心管中,加2mL水,涡旋均匀,全部加
载到固相萃取柱(4.2.24)中,控制流速小于2mL/min,用甲醇溶液(4.2.15)每次2mL,洗涤两次离心
管过柱,再用4mL甲醇溶液(4.2.15)淋洗固相萃取柱(4.2.24)。将固相萃取柱(4.2.24)抽干,用乙腈
(4.2.6)洗脱3次,每次1mL,合并洗脱液,于40℃下用氮气吹干,准确加入1mL乙腈(4.2.6),涡旋复
溶,过0.2μm微孔滤膜至进样瓶中,待测。
对于复合预混合饲料皂化上清液,混匀后准确移取1.5mL,于5mL具塞离心管中,加0.5mL
水,涡旋后,全部加载到固相萃取柱(4.2.24)中,以下淋洗、洗脱步骤同配合饲料、精料补充料和浓缩饲
料皂化上清液的淋洗、洗脱步骤,乙腈洗脱液需收集到5mL容量瓶中,并用乙腈(4.2.6)定容,混匀,过
0.2μm微孔滤膜至进样瓶中,待测。
4.5.1.2.3 在线固相萃取法
将配合饲料、精料补充料、浓缩饲料、复合预混合饲料皂化液(4.5.1.1)全部转移至100mL棕色容
量瓶中,用适量水洗涤瓶内的残渣并将洗液并入容量瓶内,用水定容,混匀,取一定体积皂化液于离心
管中,10000r/min离心15min,取适量上清液过0.2μm滤膜至进样瓶中;如果试样中维生素D3 含量
低于500IU/kg,取2mL试样溶液(4.5.1.2.1)用氮气吹干,用乙醇溶液Ⅱ(4.2.14)定容至1mL,过
0.2μm滤膜至进样瓶中,待测。
4.5.2 测定
4.5.2.1 液相色谱参考条件Ⅰ
液相色谱参考条件Ⅰ如下:
a) 色谱柱:C18柱,长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或性能相当者;
b) 流动相:甲醇(4.2.5)+水=95+5;
c) 流速:1.0mL/min;
d) 温度:25℃;
e) 进样量:20μL;
f) 检测波长:264nm。
4.5.2.2 液相色谱参考条件Ⅱ
液相色谱参考条件Ⅱ如下。
a) 色谱柱1):
1) 维生素D3 在不同品牌色谱柱的出峰时间会有所不同,对表1中流动相的梯度作适当调整,使维生素D3 在约
6.5min出峰。调整阀2切换时间,一般为维生素D3 保留时间的±0.5min范围内。
---一维色谱柱:C8 柱,长50mm,内径4.6mm,粒径2.7μm,或性能相当者;
---捕获柱:薄壳型色谱柱C18,长5mm,内径4.6mm,粒径2.7μm,或性能相当者;
---二维色谱柱:多环芳烃(PAH)柱,长100mm,内径2.1mm,粒径3.5μm,或性能相当者。
b) 流动相:
---一维:A相为甲酸溶液(4.2.16),B相为乙腈(4.2.6),C相为甲醇(4.2.5),一维梯度洗脱程
序见表1;
---二维:A相为乙腈(4.2.6),B相为甲醇(4.2.5),二维梯度洗脱程序见表2。
c) 柱温:35℃。
d) 进样量:10μL。
e) 检测波长:
---一维检测器:0min~3.5min,326nm;3.5min~25.0min,285nm;在确定维生素D3 一
维出峰时间时,波长设置为264nm。
---二维检测器:264nm。
f) 阀位置:
---0min~6min,位置1;
---6min~7min,位置2;
---7min~25min,位置1;
---柱切换-液相系统流路示意图见附录A。
表1 一维梯度洗脱程序
时间
min
A相
B相
C相
流速
mL/min
0.0 30 70 0 1.0
1.0 25 75 0 1.0
12.0 0 100 0 1.0
14.0 0 0 100 1.0
19.0 0 0 100 1.0
19.5 30 70 0 1.0
25.0 30 70 0 1.0
表2 二维梯度洗脱程序
时间
min
A相
B相
流速
mL/min
0.0 0 100 0.3
3.0 0 100 0.3
3.1 100 0 0.3
7.0 100 0 0.3
15.0 50 50 0.3
16.0 0 100 0.3
25.0 0 100 0.3
4.5.2.3 液相色谱参考条件Ⅲ
液相色谱参考条件Ⅲ见表3;在线固相萃取柱切换-液相系统流路示意图见附录B。
表3 液相色谱参考条件Ⅲ
色谱参考条件
配置系统
在线固相萃取系统 一维色谱分离系统 二维色谱分离系统
色谱柱a
聚苯 乙 烯/二 乙 烯 基 苯
(PLRP-S)柱,长12.5mm,
内径4.6mm,粒径15μm~
20μm,或性能相当者
薄壳型C8柱,长100mm,内
径4.6mm,粒径4μm,或性
能相当者
捕 获 柱:薄 壳 型 色 谱 柱 C18,长
5mm,内径4.6mm,粒径2.7μm,或
性能相当者;
多环芳烃(PAH)柱,长100mm,内
径2.1mm,粒径3.5μm,或性能相
当者
表3 液相色谱参考条件Ⅲ (续)
色谱参考条件
配置系统
在线固相萃取系统 一维色谱分离系统 二维色谱分离系统
流动相
A相为乙醇溶液Ⅲ
(4.2.17);
B相为50%乙腈-异丙醇
混合溶液(4.2.18)
A相为水;
B相为乙腈(4.2.6)
A相为乙腈(4.2.6);
B相为甲醇(4.2.5)
梯度洗脱程序 见表4 见表5 见表6
流速/(mL/min) 1 1.5 0.4
进样体积/μL 100
柱温箱温度/(C 35
检测波长
一维检测器:0min~10min,325nm;10min~25min,285nm;在确定维生素D3 一维出峰
时间时,波长设置在264nm;
二维检测器:264nm
阀1
0min~4min,1和6相连;
4min~6min,1和2相连;
6min~25min,1和6相连
阀2
0min~11.5min,1和6相连;
11.5min~12.5min,1和2相连;
12.5min~25min,1和6相连
a 维生素D3 在不同品牌色谱柱的出峰时间会有所不同,对表5中流动相的梯度作适当调整,使维生素D3 在约
12min出峰。阀的位置2设定一般定为维生素D3 保留时间的±0.5min的范围。
表4 在线固相萃取系统梯度洗脱程序
时间
min
A相
B相
0.0 100 0
4.0 100 0
4.1 0 100
11.0 0 100
11.1 100 0
25.0 100 0
表5 一维色谱分离系统梯度洗脱程序
时间
min
A相
B相
0.0 20 80
6.0 20 80
16.0 0 100
19.0 0 100
19.1 20 80
25.0 20 80
表6 二维色谱分离系统梯度洗脱程序
时间
min
A相
B相
0.0 0 100
5.0 0 100
6.0 90 10
21.0 90 10
21.1 0 100
25.0 0 100
4.5.2.4 标准系列溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下,根据选用的试样溶液制备方法,选取液相色谱参考条件进行测定。
---选用液液萃取法(4.5.1.2.1)或离线固相萃取法(4.5.1.2.2),如果试样中维生素D3含量不低于
10000IU/kg,可按照液相色谱参考条件Ⅰ(4.5.2.1)或液相色谱参考条件Ⅱ(4.5.2.2),分别取
维生素D3 标准系列溶液(4.2.21)和试样溶液(4.5.1.2.1)、(4.5.1.2.2)上机测定;如果试样中维
生素D3含量在500IU/kg~10000IU/kg范围,可按照液相色谱参考条件Ⅱ(4.5.2.2)分别取
维生素D3 标准系列溶液(4.2.21)和试样溶液(4.5.1.2.1)、(4.5.1.2.2)上机测定;如果试样中维
生素D3含量低于500IU/kg,可按照液相色谱参考条件Ⅱ(4.5.2.2)分别取维生素D3 标准系列
溶液(4.2.21)和试样溶液(4.5.1.2.1)上机测定。样品溶液中维生素D3 浓度超过了线性范
围,应将样品稀释后进样。维生素D3 标准溶液的液相色谱图见附录C的图C.1、图C.2。
---选用在线固相萃取法(4.5.1.2.3),按照液相色谱参考条件Ⅲ(4.5.2.3),分别取维生素D3 标准
系列溶液Ⅱ(4.2.22)和试样溶液(4.5.1.2.3)上机测定;维生素D3 标准溶液的液相色谱图见图
C.3。
4.5.2.5 定性
在相同试验条件下,试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中待测物的保留
时间一致,其相对偏差在±2.5%之内。
4.5.2.6 定量
以维生素D3 的质量浓度为横坐标,以色谱峰面积为纵坐标,绘制过零点的线性标准曲线,其相关
系数应不低于0.999。试样溶液中维生素D3 的质量浓度应在标准曲线的线性范围内,若超出线性范
围,应将试样溶液用乙腈(4.2.6)稀释后重新测定。单点校准定量时,试样溶液中维生素D3 的质量浓度
与标准溶液质量浓度相差不超过30%。
4.6 试验数据处理
试样中维生素D3 的含量以质量分数w1 计,数值以国际单位每千克(IU/kg)表示,多点校正按公式
(1)计算,单点校正按公式(2)计算:
w1=ρ
1×V1×V3×n
m1×V2 ×
1.25×1000 (1)
式中:
ρ1 ---从标准曲线查得的试样溶液中维生素D3 质量浓度,单位为国际单位每毫升(IU/mL);
V1 ---提取液的总体积,单位为毫升(mL);
V3 ---试样溶液最终体积,单位为毫升(mL);
n ---超出标准曲线范围后的稀释倍数;
m1 ---试样质量,单位为克(g);
V2 ---从提取液(V1)中分取的溶液体积,单位为毫升(mL);
1.25 ---将预维生素D3 的含量纳入维生素D3 总量计算的校正系数;
1000 ---换算系数。
w1=
A1×ρs1×V1×V3×n
As1×m1×V2 ×
1.25×1000 (2)
式中:
A1 ---试样溶液中维生素D3 峰面积值;
ρs1 ---标准溶液维生素D3 质量浓度,单位为国际单位每毫升(IU/mL);
V1 ---提取液的总体积,单位为毫升(mL);
V3 ---试样溶液最终体积,单位为毫升(mL);
n ---超出标准曲线范围后的稀释倍数;
As1 ---标准溶液中维生素D3 峰面积值;
m1 ---试样质量,单位为克(g);
V2 ---从提取液(V1)中分取的溶液体积,单位为毫升(mL);
1.25 ---将预维生素D3 的含量纳入维生素D3 总量计算的校正系数;
1000 ---换算系数。
测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字。
4.7 精密度
在重复性条件下,2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的百分数,见
表7。
表7 相对偏差
维生素D3 含量
IU/kg
相对偏差
1.00×102~1.00×103 30
>1.00×103~1.00×105 20
>1.00×105~1.00×106 15
>1.00×106 10
5 第二法 直接提取法
注意:处理过程在避光下操作,提取过程在通风柜中操作。
5.1 原理
试样中的维生素D3 用水和甲醇溶液提取,高效液相色谱仪测定,外标法定量。
5.2 试剂或材料
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。
5.2.1 水:GB/T 6682一级。
5.2.2 甲醇。
5.2.3 甲醇:色谱纯。
5.2.4 维生素D3 标准贮备液(40000IU/mL):称取维生素D3 标准品(C27H44O,CAS号:67-97-0),纯
度≥99.0%,或标准物质/标准样品)100mg(精确至0.00001g),于100mL棕色容量瓶中,用甲醇
(5.2.3)溶解并稀释至刻度,混匀,-20℃~-18℃避光保存,有效期为6个月。
注:1国际单位(IU)维生素D3 相当于0.025μg胆钙化醇。
5.2.5 维生素D3 标准工作液(200IU/mL):准确吸取维生素D3 标准贮备液(5.2.4)0.5mL于100mL
棕色容量瓶中,用甲醇(5.2.3)稀释至刻度,混匀,-20℃~-18℃避光保存,临用现配。
5.2.6 微孔滤膜:有机系,孔径0.2μm。
5.3 仪器设备
5.3.1 高效液相色谱仪:配有紫外吸收检测器(或二极管矩阵检测器)。
5.3.2 分析天平:精度为0.0001g和0.00001g。
5.3.3 超声波清洗器:频率不低于35000Hz。
5.4 样品
按照GB/T 20195规定制备试样,至少200g,试样经缩分、混合均匀后装入密闭容器中,2℃~8℃
避光保存,尽快测定。
5.5 试验步骤
5.5.1 试样溶液的制备
平行做两份试验。称取试样1g,精确至0.0001g,置于100mL的棕色容量瓶中,加入10mL水将
试样摇匀,在65℃以下超声波水浴中超声提取5min,加入约80mL的甲醇(5.2.2),摇匀,瓶塞不要拧
紧,置于超声波水浴中继续处理30min,处理过程中水浴温度不应超过65℃,处理完毕取出容量瓶,冷
却至室温,用甲醇(5.2.2)定容,充分摇匀,过微孔滤膜,上机测定。
5.5.2 测定
5.5.2.1 液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下:
a) 色谱柱:C18柱,长150mm,内径4.6mm,粒度5μm(或性能相当者);
b) 流动相:甲醇(5.2.3)+水=98+2;
c) 流速:1.0mL/min;
d) 温度:25℃;
e) 进样量:20μL;
f) 检测波长:264nm。
5.5.2.2 标准溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下,分别取维生素D3 标准工作液(5.2.5)和试样溶液(5.5.1)上机测定。维生素
D3 标准溶液的液相色谱图见图C.4。
5.5.2.3 定性
在相同试验条件下,试样溶液中待测物的保留时间应与标准系列溶液(浓度相当)中待测物的保留
时间一致,其相对偏差在±2.5%之内。
5.5.2.4 定量
在上述液相色谱条件下,将维生素D3 标准工作液(5.2.5)和试样溶液(5.5.1)注入液相色谱仪测
定,外标法定量测定。
5.6 试验数据处理
试样中维生素D3 的含量,以质量分数w2 计,单位为国际单位每千克(IU/kg)表示,按公式(3)
计算。
w2=
A2×ρ2×V
As2×m2 ×
1.07×1000 (3)
式中:
A2 ---试样溶液(5.5.1)峰面积值;
ρ2 ---标准溶液维生素D3 质量浓度,单位为国际单位每毫升(IU/mL);
V ---试样溶液(5.5.1)的总稀释体积,单位为毫升(mL);
As2 ---维生素D3 标准工作液(5.2.5)峰面积值;
m2 ---试样质量,单位为克(g);
1.07 ---将预维生素D3 的含量纳入维生素D3 总量计算的校正系数;
1000 ---换算系数。
测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字。
5.7 精密度
在重复性条件下,2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的10%。
附 录 A
(资料性)
离线固相萃取柱切换-液相系统流路示意图
离线固相萃取柱切换-液相系统流路示意图见图A.1~图A.3。
第一阶段:0min~6min,位置1、2相连;净化维生素D3 阶段,第一维色谱柱实现维生素D3 与杂质
的初步分离图见图A.1。
图A.1 离线固相萃取柱切换-液相系统流路示意图(初始状态)
第二阶段:6min~7min,位置1、6相连;捕获维生素D3 阶段,阀在维生素D3 出峰前切换至1-6
连通图见图A.2。
图A.2 离线固相萃取柱切换-液相系统流路示意图(阀切换捕获维生素D3 状态)
第三阶段:7min~25min位置1、2相连;为二次分离阶段,第二维色谱柱实现杂质与维生素D3 分
离图见图A.3。
图A.3 离线固相萃取柱切换-液相系统流路示意图(阀切换维生素D3 分离状态)
附 录 B
(资料性)
在线固相萃取柱切换-液相系统流路示意图
在线固相萃取柱切换-液相系统流路示意图见图B.1~图B.5。
第一阶段:0m......
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