路径: 主页 > SN/T > 第65页 > SN/T 1454-2004 | 标准编号 | SN/T 1454-2004 (SN/T1454-2004) | | 中文名称 | 鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法 | | 英文名称 | Marekdisease virus isolation and identification methods | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 11.220 | | 字数估计 | 8,881 | | 发布日期 | 6/1/2004 | | 实施日期 | 2004-12-01 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 | SN/T 1454-2004
Marekdisease virus isolation and identification methods
书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN／T１４５４-２００４
鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法
２００４-０６-０１发布
２００４-１２-０１实施
中 华 人 民 共 和 国
国家质量监督检验检疫总局 发 布
前言
本标准的附录Ａ、附录Ｂ均为规范性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。
本标准由中华人民共和国陕西出入境检验检疫局和山东出入境检验检疫局负责起草。
本标准主要起草人：陈茂盛、管恩平、马玉玲、寇改霞。
本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。
SN／T１４５４-２００４
鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法
１ 范围
本标准规定了鸡马立克氏病病毒（ＭＤＶ）的分离鉴定方法。
本标准适用于鸡马立克氏病（ＭＤ）流行病学调查和口岸检疫。
２ 材料准备
２．１ 一日龄 ＭＤ敏感鸡：用ＳＰＦ种蛋孵化。
２．２ 鸭胚成纤维细胞（ＤＥＦ）的制备：见附录Ａ。
２．３ 鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）的制备：同２．２。
２．４ 细胞培养液的制备：见附录Ｂ。
２．５ 淋巴细胞分层液。
２．６ 标准的 ＭＤＶ分型单克隆抗体。
２．７ 缓冲溶液配制：
磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）；
含０．０５％吐温-２０的ＰＢＳ。
以上溶液配制方法见附录Ｂ。
２．８ 标准 ＭＤＶ：ＭＤＶⅠ型病毒ＧＡ毒株。
３ 采样
挑选临床发病的 ＭＤ疑似病鸡，无菌采集枸橼酸钠抗凝全血５ｍＬ／鸡～１０ｍＬ／鸡，加入淋巴细胞
分层液，２００ｇ离心５ｍｉｎ，分离收集淋巴细胞，并用无菌ＰＢＳ洗涤两次，用细胞维持液稀释成１０７ 个／
ｍＬ淋巴细胞的细胞悬浮液直接使用或者加入１５％的二甲基亚砜后保存在液氮（-１９６℃）中备用。
４ 操作方法
４．１ 接种和培养
取生长良好的ＤＥＦ单层，弃去维持液，接种０．２ｍＬ处理好的淋巴细胞悬浮液，置含５％二氧化碳
的培养箱，３７℃下吸附１．５ｈ。补充适量维持液继续培养，２４ｈ内换液一次，以后每２ｄ～３ｄ换液一次。
在培养过程中每日观察细胞病变（ＣＰＥ）产生情况，同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。
４．２ 收集
在空白细胞对照瓶的细胞生长良好的前提下，将产生广泛ＣＰＥ（蚀斑形成面积占３０％以上）的ＤＥＦ
单层培养瓶中的维持液弃去，用０．０１％胰酶消化，加细胞生长液制成细胞悬浮液直接供鉴定用，或者加
二甲基亚砜后置液氮（-１９６℃）中保存备用。
４．３ 克隆
将收集的具有广泛ＣＰＥ的细胞悬浮液进行稀释，接种于９６孔细胞培养板，使每孔平均含有１个细
胞，继续培......
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