[PDF] SN/T 4656.7-2020 - 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| SN/T 4656.7-2020 | 379 | SN/T 4656.7-2020 | <=4 | 进出口纺织品生物安全检验方法 第7部分:铜绿假单胞菌 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 4656.7-2020 (SN/T4656.7-2020) |
| 中文名称 | 进出口纺织品生物安全检验方法 第7部分:铜绿假单胞菌 |
| 英文名称 | (Import and export textiles biosafety inspection method - Part 7: Pseudomonas aeruginosa) |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | W09 |
| 国际标准分类 | 59.080.99 |
| 字数估计 | 18,167 |
| 发布日期 | 2020-08-27 |
| 实施日期 | 2021-03-01 |
| 标准依据 | 海关总署公告2020年第98号 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 4656.7-2020: 进出口纺织品生物安全检验方法 第7部分:铜绿假单胞菌
SN/T 4656.7-2020 英文名称: (Import and export textiles biosafety inspection method Part 7: Pseudomonas aeruginosa)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
进出口纺织品生物安全检验方法
第 7 部分：铜绿假单胞菌
中华人民共和国海关总署 发 布
1 范围
SN/T 4656 的本部分规定了进出口纺织品中铜绿假单胞菌的检验方法。
本部分适用于进出口纺织品铜绿假单胞菌的检验。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定
SN/T 1538.1 培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则
SN/T 1538.2 培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南
SN/T 4656.8 进出口纺织品生物安全检验方法 第 8 部分：通则
4 材料和设备
4.1 无菌剪刀、镊子。
4.2 电子天平：感量 0.01 g。
4.3 无菌均质袋。
4.4 拍击式均质器：400 mL。
4.5 无菌规格板：20 cm2。
4.6 无菌干燥棉拭子。
4.7 微量移液器：量程 0.5 μL ～ 20 μL，量程 100 μL ～ 1 000 μL，量程 1 mL ～ 10 mL。
4.8 无菌小三角瓶：25 mL。
4.9 无菌玻璃平皿或一次性无菌塑料平皿：15 mm×90 mm。
4.10 无菌 L 形玻璃捧。
4.11 恒温培养箱：36 ℃ ±1 ℃、42 ℃ ±1 ℃。
4.12 接种环。
4.13 显微镜：10× ～ 100×。
4.14 全自动微生物生化鉴定系统。
4.15 灭菌离心管：1.5 mL。
4.16 高速冷冻离心机：2 000 r/min ～ 13 000 r/min。
4.17 LAMP 反应管。
4.18 水浴锅：65 ℃ ±1 ℃。
4.19 LAMP 实时浊度仪。
5 培养基和试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；分子检测实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的
要求。
5.1 无菌生理盐水：见 A.2。
5.2 SCDLP 液体培养基：见 A.3。
5.3 乙酰胺琼脂：见 A.4。
5.4 革兰氏染色液：见 A.5。
5.5 氧化酶试剂：见 A.6。
5.6 硝酸盐蛋白胨水培养基：见 A.7。
5.7 营养琼脂：见 A.8。
5.8 灭菌双蒸水。
5.15 铜绿假单胞菌标准菌株。
6 样品制备
6.1 称量法
无菌方法打开送检样品，用无菌剪刀（4.1）均匀剪样，在电子天平（4.2）上准确称取剪下的
样品 25 g，剪碎后加入到盛有 225 mL 无菌稀释液的无菌均质袋 (4.3) 中，用拍击式均质器 (4.4) 拍打
1 min ～ 2 min，充分混匀，得到一个 1:10 的样品匀液。
6.2 多点采样洗脱法
无菌方法打开送检样品，在样品四周和中间均匀布控 5 个采样点，用无菌规格板（4.5）按每个
采样点按 4 cm×5 cm（20 cm2）面积范围剪裁，每 20 cm2 采样面积为 1 份检样，每件样品共采集 5 份
检样, 采样面积为 100 cm2。将上述采集好的 5 份检样放入盛有 200 mL 无菌稀释液的无菌均质袋 (4.3) 中，
用拍击式均质器 (4.4) 拍打 1 min ～ 2 min，充分混匀，制成的样品匀液作为原液。
6.3 棉拭子涂抹法
无菌方法打开送检样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子（4.6），在样品四周和中间均匀布控
5 个采样点，用无菌规格板（4.5）比照按每个采样点 20 cm2 面积范围均匀涂抹，每个采样点用 1 个
无菌干燥棉拭子（4.6），在 4 cm×5 cm（20 cm2）面积范围均匀涂抹，立即用无菌剪刀（4.1）剪去棉
拭子手接触部分，将涂抹部分一块放入盛有 50 mL 无菌稀释液的无菌均质袋（4.3）中混匀，制成 1:10
的样品匀液。
6.4 样品制备方法的选择
6.4.1 样品制备一般依 6.1 方法为基准方法。
6.4.2 当样品为面积较大或较厚实或多孔时，样品制备应采用 6.2 方法。采用 6.2 方法时如果被检样品
面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。
6.4.3 当样品质地致密，不容易剪碎制备；或样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用 6.3
方法。
6.4.4 采用 6.1、6.2 方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液转种时，稀释液可适
当增加直至足够吸出转种。
7 方法一 铜绿假单胞菌定量检验方法 平板计数法
7.1 原理
铜绿假单胞菌具有乙酰胺酶, 能利用乙酰胺作为碳源，并分解乙酰胺产碱。样品接种乙酰胺培养
基后，目标菌能使乙酞胺培养基变红；结合铜绿假单胞菌具有氧化酶阳性、能使硝酸盐还原产气和在
42 ℃生长的特性，准确判定铜绿假单胞菌。
7.2 检验程序
检验程序见图 1。
24 h±2 h36 ℃±1 ℃
10倍系列稀释
按 6.1、6.2、6.3制备的生理盐水样品匀液
42 生长试验
无可疑菌落
结果报告
硝酸盐还原产气试验氧化酶试验染色观察
选择 2个～3个连续的适宜稀释度的样品匀
液，接种乙酰胺琼脂平板
挑取可疑菌落做确证试验
7.3 操作步骤
7.3.1 样品的稀释
用微量移液器（4.7）移取制备好的样品匀液 1 mL ，缓慢注于盛有 9 mL 无菌生理盐水 (5.1) 的无
菌小三角瓶（4.8）中（注意吸头尖端不要触及液面），振摇小三角瓶或换用 1 支无菌吸头反复吹打使
其混合均匀，制成下一稀释度的样品匀液。按照以上操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递
增稀释 1 次，换用 1 次无菌吸头。
7.3.2 样品接种
根据样品的实际污染情况，选择 2 个～ 3 个合适的稀释度样品匀液（包括原液），每个稀释度分
别吸取 1 000 μL 样品匀液以 500 μL、500 μL 的接种量分别接种两块表面干燥的乙酰胺琼脂（5.3）平板，
然后用无菌 L 形玻璃捧（4.10）均匀涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。如样液不易吸收，可将
平板放在 36 ℃ ±1 ℃恒温培养箱（4.11）培养 1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，培
养 24 h±2 h。
7.3.3 典型或可疑菌落计数
铜绿假单胞菌在乙酰胺琼脂（5.3）平板上菌落形态：乳白色扁平菌落，湿润，边缘整齐，菌落
周围培养基颜色变红。挑选有典型或可疑铜绿假单胞菌菌落，且同一稀释度的两个平板所有典型或可
疑菌落数合计在 20 CFU ～ 200 CFU 范围内的平板，计数其典型或可疑菌落数。
7.3.4 确证试验
7.3.4.1 概述
从计数的乙酰胺琼脂（5.3）平板上至少挑取 5 个（少于 5 个则全部挑取）典型或可疑菌落，做
如下确证试验。
7.3.4.2 染色镜检
挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上单个菌落，涂片，革兰氏染色液（5.4）染色，显微镜（4.13）下
观察其菌落形态。铜绿假单胞菌显微镜下为革兰氏阴性菌，细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，
成对或短链状排列。
7.3.4.3 氧化酶试验
取一张洁净滤纸放在灭菌玻璃平皿（4.9）内，用微量移液器（4.7）吸取氧化酶试剂（5.5）滴加
一滴于滤纸上，仅使滤纸湿润，不可过湿，用接种环（4.12）挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上单个菌落
涂在滤纸片上，在 10 s 内出现蓝色或蓝紫色者为阳性反应，不变色为阴性反应，铜绿假单胞菌氧化
酶试验呈阳性反应。也可购买商品化氧化酶试剂或氧化酶试纸并按其说明书进行试验。
7.3.4.4 硝酸盐还原产气试验
挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上菌落，接种在硝酸盐蛋白胨水培养基（5.6）中，36 ℃ ±1 ℃培
养 24 h±2 h，观察结果，硝酸盐蛋白胨水培养基（5.6）内的小倒管中有气体者，即为阳性，否则为
阴性。铜绿假单胞菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气，因此铜绿假单胞菌硝酸盐还原产气
试验阳性。
7.3.4.5 42 ℃生长试验
挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上菌落，划线接种在营养琼脂（5.7）培养基制成的斜面上，42
℃ ±1 ℃培养 48 h±2 h，铜绿假单胞菌能 42 ℃生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。
如选择全自动微生物生化鉴定系统（4.14），可挑取乙酰胺琼脂（5.3）平板上可疑菌落接种营养
琼脂（5.7）平板 36 ℃ ±1 ℃培养 20 h±2 h 进行纯化，挑取纯化后的菌落制成一定浓度的菌悬液，
使用全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
7.3.5 结果计算
7.3.5.1 只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计在 20 CFU ～ 200 CFU 之间，计数该稀释
度两个平板上合计的典型或可疑菌落。
7.3.5.2 最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计小于 20 CFU，计数该稀释度两个平板上合计
的典型或可疑菌落。
7.3.5.3 所有稀释度平板上的菌落数合计均大于 200 CFU 且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度
两个平板上合计的典型或可疑菌落。
以上典型或可疑菌落确证后按式（1）计算：
7.3.5.4 两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数合计均在 20 CFU ～ 200 CFU 之间，则这两个连续
稀释度平板上的典型或可疑菌落都应计数；菌落确证后按式（2）计算。
7.3.5.5 所有稀释度的平板上都没有典型或可疑菌落，则直接以小于 1 乘以最低稀释倍数报告结果。
7.3.6 示例
一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见 B.1 示例 1，两个稀释度计数结果都在合适范围
内情况参见 B.2。
7.4 结果报告
根据乙酰胺琼脂（5.3）平板上典型或可疑菌落验证结果，按照 7.3.5 中公式计算，报告每 cm2、
每 g 或每 100 cm2 样品铜绿假单胞菌数，以 CFU/cm2 、CFU/g 或 CFU/100 cm2 表示。如 T 值为 0，
则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告；如 T 值小于 100 CFU，以实际数值报告；如 T 值大于或等于 100
CFU 时，报告时数值按 GB/T 8170 规则进行修约，用 10 的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。
8 方法二 铜绿假单胞菌环介导恒温扩增（LAMP）法
8.1 原理
根据铜绿假单胞菌特有的 ETA 保守序列，设计一组 LAMP 特异性引物，利用 DNA 聚合酶启动循
环链置换反应，在等温条件 (65 ℃左右) 下保温 30 min ～ 60 min 特异、高效、快速的完成核酸扩增。
扩增后的产物形成白色沉淀，通过对比观察或通过浊度仪生成的浊度曲线判定结果。
8.2 检验程序
检验程序见图 2。
8.3 操作步骤
8.3.1 样品增菌
将按 6.1、6.2 或 6.3 制备好的 SCDLP 液体培养基增菌液放入 36 ℃ ±1 ℃恒温培养箱（4.11）中，
增菌培养 20 h±2 h。
8.3.2 DNA 模板的制备
取 1 mLSCDLP 液体培养基增菌液放入 1.5 mL 灭菌离心管（4.15）内，置高速冷冻离心机（4.16）
内 10 000 r/min 离心 5 min，吸弃上清；加入 1 mL 灭菌双蒸水（5.21）混匀，高速冷冻离心机（4.14）
内 10 000 r/min 离心 5 min，吸弃上清；然后加灭菌双蒸水（5.8）100 μL 混匀，置 100 ℃煮沸 5 min，
高速冷冻离心机（4.16）内 10 000 r/min 离心 2 min，取上清作为 DNA 模板，可-20 ℃存放备用。
也可使用等效的商品化 DNA 提取试剂盒并按其说明操作。
8.3.3 DNA 扩增反应
8.3.3.1 扩增准备
根据样本数量设定所需要的 LAMP 反应管（4.17）数 n(n=1 管空白对照 +1 管阴性对照 +1 管阳性
对照 + 样本数)。取出 n 个 LAMP 反应管（4.17）。扩增反应体系见表 1，按表 1 计算各试剂的使用量，
按表 1 的顺序加入灭菌离心管（4.15）内，颠倒混匀，2 000 r/min 离心 10 s。
8.3.3.2 空白对照、阴性对照、阳性对照
每次实验应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。
空白对照：以水代替 DNA 模板。
阴性对照：以水代替样品按 8.3.2 提取模板 DNA 作为 LAMP 反应的模板。
阳性对照：铜绿假单胞菌标准菌株（5.15）增菌后按 8.3.2 提取模板 DNA 作为 LAMP 反应的模板。
8.3.3.3 加样
将 8.3.2 制备好的 DNA 模板、空白对照、阴性对照、阳性对照各取 2 μL 加入 8.3.3.1 准备好的的
反应管中，使反应体系达到 25 μL。盖紧管盖，混匀，2 000 r/min 离心 10 s。
8.3.3.4 扩增
将 8.3.3.3 反应管置水浴锅（4.18）或 LAMP 实时浊度......