路径: 主页 > SN/T > 第62页 > SN/T 5185-2020 | 标准编号 | SN/T 5185-2020 (SN/T5185-2020) | | 中文名称 | 猪副伤寒检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical specifications for swine paratyphoid quarantine) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 24,229 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5185-2020: 猪副伤寒检疫技术规范
SN/T 5185-2020 英文名称: (Technical specifications for swine paratyphoid quarantine)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
猪副伤寒检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
1 范围
本文件规定了猪副伤寒的临床诊断、病原的分离和鉴定、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应
和实时荧光聚合酶链式反应鉴定技术。
本文件适用于猪副伤寒临床诊断和实验室检疫。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
4 临床诊断
4.1 临诊症状
4.1.1 急性败血性
体温突然升高（41 ℃～42 ℃），精神不振，食欲废绝。呼吸困难，耳根、胸前和腹下皮肤有紫红
色斑点，后期或有下痢。有时在出现临诊症状后 24 h 内死亡，但多数病程为 2 d～4 d，病死率很高。
4.1.2 亚急性和慢性
病猪体温升高（40.5 ℃～41.5 ℃），精神不振，寒颤，喜钻垫草，扎堆，眼有粘性或脓性分泌物，
少数角膜混浊，严重者发展为溃疡，甚至眼球被腐蚀。病猪食欲不振，初便秘后下痢，粪便淡黄色或
黄绿色，恶臭。被毛粗乱，贫血，长期拉稀，粪便含纤维素、坏死组织或饲料凝块。有的皮肤出现弥
漫性湿疹。生长发育不良，呈典型僵猪。
4.2 病理变化
4.2.1 急性型
主要为败血症变化。脾常肿大，色暗带有蓝色，坚实似橡皮，脾髓质不软化。肠系膜淋巴结索状
肿大，其他淋巴结也有肿大，呈大理石状。肝、肾也有不同程度的肿大、充血和出血，肝实质有时可
见黄灰色坏死点。全身黏膜、浆膜均有不同程度的出血斑点，肠胃黏膜可见急性卡他性炎症。
4.2.2 亚急性和慢性型
主要为坏死性肠炎。盲肠、结肠肠壁增厚，黏膜覆盖一层弥漫性坏死和腐乳状物质，呈糠麸状，
底部为红色、边缘不规则的溃疡面。肠系膜淋巴结索状肿胀，部分呈干酪样变。脾肿大。肝有时可见
黄灰色坏死点。
5.3 样品采集
取样按照 GB/T 18088 的规定执行。无菌采集存活动物的新鲜粪便或直肠棉拭子样品；病死或带
菌动物的肝脏、胆囊、脾脏及其他病变组织，盲肠扁桃体及肠内容物。
5.4 样品保存
样品均放入 4 ℃冰箱内保存，并在冷藏状态下 24 h 内送到指定实验室。
5.5 细菌分离
5.5.1 总则
涉及病原的检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废弃物处理应按照 GB/T 19489 要求
进行。
5.5.2 非污染样品
取组织器官和胆囊内容物，无菌条件下选择 2 种选择性琼脂平板（科玛嘉显色培养基琼脂、HE
琼脂、XLD 琼脂、DHL 琼脂、BS 琼脂等）进行划线接种培养，同时将组织器官匀浆，1 ：10 的体积
接种 BPW，36 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h，之后再按 1 ：10 的体积转接 TTB 增菌液和 SC 增菌液，分
别于 42 ℃ ±1 ℃和 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h 后，再选择 2 种同样的选择性琼脂平板划线接种培养，
若出现表 1 中的菌落特征，可以判为可疑菌落，挑取可疑菌落进一步鉴定。如果没有发现可疑菌落，
则判定为细菌分离为阴性。
5.5.3 污染样品
将直肠棉拭子、新鲜粪便、盲肠扁桃体、肠内容物等污染样品（非液体性样品最好先制成匀浆
液），按 1 ：10 的体积接种 BPW，36 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h，其余步骤同 5.5.2.
5.6 生化试验
5.6.1 三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验
自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于
底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃ ±1 ℃培
养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门菌属的反应
结果见表 2。
5.6.2 二次生化试验
根据 5.6.1 初步判断结果，从可疑沙门菌对应的营养琼脂平板上挑取菌落分别接种蛋白胨水（供
做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，于 36 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h，必要
时可延长至 48 h，个别情况要补做甘露醇和山梨醇试验或 ONPG 试验，按表 3 判定结果。将已挑菌落
的营养琼脂平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查。
5.6.4 全自动微生物生化鉴定系统
可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，根据 5.6.1 的初步判断结果，从营养琼脂
平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生
化鉴定系统进行鉴定。
5.7 血清学试验
5.7.1 抗原的准备
一般采用 1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O 血清不凝集时，将菌株接种在
琼脂量较高的 （如 2％～3％） 培养基上再检查；如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，
可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将
菌株接种在 0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查。
5.7.2 多价菌体抗原（O）鉴定
在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上
部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对
照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对
着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
5.7.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定
同 5.7.2。
5.8 结果判定
生化试验结果与沙门菌属生化特性完全符合时，判定为沙门菌阳性。生化试验沙门菌可疑时，综
合生化试验和血清学鉴定结果，若血清学反应 O 抗原或 H 抗原阳性，则判定为沙门菌阳性；若血清
学反应 O 抗原和 H 抗原全部阴性，则判定为沙门菌阴性。
6 ELISA 试验
6.1 仪器和设备
6.1.1 96 孔酶标板。
6.1.2 振荡混匀器。
6.1.3 洗板机。
6.1.4 酶标仪。
6.1.5 单道可调微量移液器一套（0.5 μL～10 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL）、12 道可调微
量移液器（10 μL～100 μL）。
6.1.6 冰箱（2 ℃～4 ℃和 –20 ℃）。
6.2 试剂
6.2.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。
6.2.2 ELISA 标准抗原：肠炎沙门菌 LPS，由指定单位提供。
6.2.3 标准阴性血清。
6.2.4 标准阳性血清。
6.2.5 HRP 标记的抗体。
6.2.6 BSA。
6.2.7 吐温-20。
6.2.8 0.01 mol/L PBS 缓冲液，配制方法见 A.16。
6.2.9 包被液，配制方法见 A.17。
6.2.10 洗涤液，配制方法见 A.18。
6.2.11 封闭液，配制方法见 A.19。
6.2.12 稀释液，配制方法见 A.20。
6.2.13 底物溶液，配制方法见 A.21。
6.2.14 终止液，配制方法见 A.22。
6.3 样品采集制备
常规方法采集动物血，自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。样品 1 周内检测
可存放于 2 ℃～8 ℃，超过 1 周应置于-20 ℃。
6.4 操作步骤
6.4.1 也可采用其他等效的商业化试剂盒，根据试剂盒说明书进行操作。
6.4.2 用包被液将标准抗原稀释至 1 μg/mL，将稀释好抗原加入 96 孔酶标板内，每孔加 100 μL，
4 ℃包被过夜。
6.4.3 每个反应孔加入约 300 μL 的洗涤液进行洗涤，洗涤 5 次，最后一次在洁净的吸水纸上将酶标
板拍干。
6.4.4 每孔加封闭液 200 μL，37 ℃孵育 1 h。
6.4.5 重复步骤 6.4.3。
6.4.6 待检血清用稀释液作 1 ：20 稀释，把稀释好的血清加入反应孔内，每孔 100 μL ；同时设立阳
性血清、阴性血清对照各 2 孔，每孔 100 μL。置 37 ℃孵育 1 h。
6.4.7 重复步骤 6.4.3。
6.4.8 把稀释好的 HRP 标记抗体加入各孔，每孔加 100 μL，置室温反应 30 min。
6.4.9 重复步骤 6.4.3。
6.4.10 每孔加入底物溶液 100 μL，室温条件下避光孵育 15 min。
6.4.11 每孔加 100 μL 终止液终止反应，10 min 内以 490 nm 波长测 OD 值。
6.5 结果判定
6.5.1 判定条件
只有当阳性对照平均 OD 值≥ 1.0，阴性对照平均 OD 值≤ 0.20 时，试验成立可进行结果判定；
否则重新试验。
6.5.2 计算 P/N 值
P/N 值计算见式（1）：
P/N = （待检血清平均 OD 值 - 空白对照平均 OD 值）
（阴性血清平均 OD 值 - 空白对照平均 OD 值）
6.5.3 判定标准
6.5.3.1 P/N ≥ 2.0 时，判为待检血清猪副伤寒抗体阳性。
6.5.3.2 1.5 ≤ P/N ＜ 2.0 时，判为可疑。对可疑样品重检一次，重检后若 P/N ≥ 1.5，判为待检血
清猪副伤寒抗体阳性；若 P/N ＜ 1.5，判为待检血清猪副伤寒抗体阴性。
6.5.3.3 P/N ＜ 1.5，判为待检血清猪副伤寒抗体阴性。
7 聚合酶链式反应（PCR）
7.1 仪器和设备
7.1.1 二级生物安全柜。
7.1.2 高速冷冻离心机。
7.1.3 水浴锅。
7.1.4 PCR 扩增仪。
7.1.5 水平电泳仪。
7.1.6 凝胶成像仪。
7.1.7 微量移液器。
7.1.8 高压灭菌锅。
7.4 质控物质
使用肠炎沙门菌标准菌株（ATCC13 076）作为阳性对照；使用不含沙门菌的组织或培养物作为
阴性对照；用 ddH2O 作为空白对照。
7.5 样品采集
同 5.3。
7.6 样品的准备
将受测细菌单个菌落接种到 10 mL BPW 增菌液内，临床样品（非液体性样品最好先制成匀浆液）
按 1 ：10 的体积接种 BPW，36 ℃ ±1 ℃培养 18 h～24 h ；同时制备阳性对照和阴性对照菌株菌液。
无菌取 1.5 mL 培养物到灭菌的 EP 管内，12 000 r/min 离心 3 min，弃去上清液，加入 1.5 mL ddH2O
水重悬沉淀；12 000 r/min 离心 3 min，弃去上清液，再次加入 1 mL ddH2O 重悬沉淀。
7.7 DNA 提取
将上述菌重悬液在沸水中煮 15 min，10 000 r/min 离心 3 min 沉淀菌体碎片，上清液内即含有细
菌基因组 DNA，将上清液转移到干净的离心管内-20 ℃保存备用。细菌基因组 DNA 的提取也可采用
等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按照说明书要求进行操作。
7.8 PCR 扩增
7.8.1 反应体系
在 PCR 中加入 10×PCR 缓冲液 2.5 μL、5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.25 μL、10 μmol/L 的引物 hutF
和 hutR 各 1.0 μL、2.5 mmol/L dNTPs 0.5 μL、模板 DNA 2.0 μL，补充 ddH2O 至 25 μL。PCR 扩增可以
采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。
7.8.2 反应程序
94 ℃预变性 5 min ；之后 94 ℃变性 45 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 30 个循环；72 ℃
补充延伸 10 min，4 ℃保温。同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。
7.8.3 琼脂糖凝胶电泳
用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5% 的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶
面。将 6 μL 样品和 2 μL 上样缓冲液按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA 相对分子质量标
准物 Marker 作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当指示剂到达底部时停止。
7.9 凝胶成像分析和测序
将电泳完毕的凝胶放入含 0.5 μg/mL EB 溶液中染色 10 min～30 min 后，在水中漂洗凝胶，用凝
胶成像仪观察并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约 495 bp 的 DNA 片段，应切胶回收
DNA 片段进行测序，参考序列参见 B.......
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