路径: 主页 > SN/T > 第62页 > SN/T 5196-2020 | 标准编号 | SN/T 5196-2020 (SN/T5196-2020) | | 中文名称 | 猪轮状病毒感染检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical specification for quarantine of porcine rotavirus infection) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 13,161 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5196-2020: 猪轮状病毒感染检疫技术规范
SN/T 5196-2020 英文名称: (Technical specification for quarantine of porcine rotavirus infection)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
代替 SN/T 1162-2002
猪轮状病毒感染检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020 的规定起草。
本文件由中国人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国南宁
海关、中华人民共和国深圳海关、中华人民共和国海口海关、厦门瑞德利校准检测技术有限公司。
本文件主要起草人：张体银、姜焱、聂丹、郑腾、花群义、李丹丹、王武军、白泉阳、张志灯、
于师宇、陈美传。
猪轮状病毒感染检疫技术规范
1 范围
本文件规定了猪轮状病毒感染酶联免疫吸附试验、反转录 - 聚合酶链反应和实时荧光反转录 -
聚合酶链反应检测技术。
本文件适用于猪轮状病毒感染的抗体检测和病原核酸鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
4 仪器和设备
4.1 Ⅱ级生物安全柜。
4.2 高压灭菌器。
4.3 96 孔酶标板。
4.4 恒温培养箱。
4.5 洗板机。
4.6 酶标仪。
4.7 冷冻离心机。
4.8 单道可调微量移液器（2 μL～20 μL，20 μL～200 μL，100 μL～1 000 μL）。
4.9 多道可调微量移液器（10 μL～100 μL）。
4.10 PCR 仪。
4.11 水平电泳仪。
4.12 凝胶成像仪。
4.13 荧光 PCR 仪。
4.14 冰箱（2 ℃～8 ℃和 –20 ℃）。
5 试剂和材料
5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。
5.2 猪轮状病毒 VP6 蛋白。
5.3 标准阳性血清：猪轮状病毒疫苗免疫仔猪制备，经病毒中和试验检测为阳性。
5.4 标准阴性血清：无母源抗体、未免疫猪轮状病毒疫苗的仔猪血清，经病毒中和试验检测为阴性。
5.5 灭菌生理盐水：配制见附录 A 中 A.1。
5.6 包被液：配制见附录 A 中 A.2。
5.7 磷酸盐缓冲液（PBS）：配制参见附录 A 中 A.3。
5.8 洗涤液：配制见附录 A 中 A.4。
5.9 封闭液：配制见附录 A 中 A.5。
5.10 样品稀释液：配制见附录 A 中 A.6。
5.11 抗猪 PRV 酶标抗体。
5.12 底物显色液：配制见附录 A 中 A.7。
5.13 终止液：配制见附录 A 中 A.8。
5.14 焦碳酸二乙酯处理水（DEPC 水）：配制见附录 A 中 A.9。
5.15 Trizol。
5.16 三氯甲烷。
5.17 异丙醇。
5.18 无水乙醇。
5.19 反转录试剂盒。
5.20 Taq DNA 聚合酶。
5.21 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。
5.22 10×PCR 缓冲液。
5.23 琼脂糖。
5.24 分子量标准（100 bp ～600 bp）。
5.25 TBE 电泳缓冲液，配制见附录 A 中 A.10。
5.26 上样缓冲液，配制见附录 A 中 A.11。
5.27 EB（10 mg/mL），配制见附录 A 中 A.12。
5.28 DNA 纯化回收试剂盒。
5.29 质控物质：阳性对照为含 PRV 的阳性组织或含有 PRV 的病毒培养液；阴性对照为不含 PRV 的
组织。
5.30 RT-PCR 用引物 F1、R1 序列：
扩增 PRV 各毒株保守序列中大小为 309 bp 片段（参见附录 B），引物用 ddH2O 溶解至 10 μmol/L 后，
保存于-20 ℃备用。
5.31 实时荧光 RT-PCR 用引物 F2、R2 和探针序列：
引物和探针分别用 ddH2O 溶解至 10 μmol/L 后，保存于-20 ℃备用。
6 采样和制样
6.1 根据 GB/T 18088 确定采样动物数量；涉及病原检测应在二级生物安全实验室进行，样品保存和废
弃物处理应按照 GB 19489 要求进行。
6.2 血清样品：通过前腔静脉采血法无菌采血，待其自然凝固后，4 000 r/min 离心 10 min。
6.3 粪便或肛拭子样品：采集粪便样品，加等体积灭菌生理盐水研磨匀浆，4 ℃ 5 000 r/min 离心
15 min，收集上清液待检。采集肛拭子样品，用少量灭菌生理盐水浸润后，取上清液待检。
6.4 组织样品：采集肠、胃等组织样品，加等体积灭菌生理盐水研磨匀浆，4 ℃ 5 000 r/min 离心
15 min，收集上清液待检。
7 ELISA 检测方法
7.1 操作步骤
7.1.1 包被抗原：将纯化的 VP6 蛋白用包被液稀释至 3 μg/mL，每孔 100 μL，包被酶标板，封口后，
2 ℃～8 ℃包被 12 h。ELISA 检测方法可以采用等效的商品化 ELISA 抗体检测试剂盒，根据试剂盒说明
书进行操作。
7.1.2 弃去孔内液体，每个反应孔加入约 300 μL 的洗涤液进行洗涤，洗涤 5 次，最后一次在洁净的吸
水纸上将酶标板拍干。
7.1.3 封闭：每孔加入封闭液 250 μL，置 37 ℃培养箱中封闭 2 h。
7.1.4 重复步骤 8.1.2，置于 4℃保存备用。
7.1.5 将待检血清用样品稀释液作 1:100 稀释，每孔加入 100 μL，同时加入阴性对照和阳性对照血清各
2 孔，每孔 100 μL。置于 37 ℃ 培养箱中反应 1 h。
7.1.6 重复步骤 8.1.2。
7.1.7 将抗猪 PRV 酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加入 100 μL，置于 37 ℃ 培养箱中反应 1 h。
7.1.8 重复步骤 8.1.2。
7.1.9 显色：每孔加入 100 μL 底物显色液，轻柔摇匀，37 ℃避光显色 10 min。
7.1.10 终止反应：每孔加入 100 μL 终止液终止反应。
7.1.11 读数：在酶标仪上读取 450 nm 吸光值。
7.2 结果判定
7.2.1 在酶标测定仪上检测各孔光吸收值（OD450），计算阳性对照平均 OD450 值和阴性对照平
均 OD450 值。阳性对照血清平均 OD450 值大于 0.6，阴性对照血清平均 OD450 值小于 0.16，试验
成立。
7.2.2 当样品孔平均 OD450 值（P）与阴性对照平均 OD450 值（N）之比大于或等于 2.0（即 P/N ≥ 2.0）时，
判定为 PRV 抗体阳性。
7.2.3 当样品孔平均 OD450 值（P）与阴性对照平均 OD450 值（N）之比小于 2.0（即 P/N＜ 2.0）时，判
定为 PRV 抗体阴性。
8 RT-PCR 方法
8.1 设立对照
每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照为
不含 PRV 的组织；阳性对照为含 PRV 的阳性组织或含有 PRV 的病毒培养液。
8.2 RNA 提取
分别取 200 μL 待检样品，加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器充分吹打 10～20 次，室温放置 5 min ；
加入 200 μL 三氯甲烷，旋涡振荡 30 s 混匀，室温放置 15 min ；12 000 r/min 离心 15 min ；取上层水
相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 ℃放置 20 min ；12 000 r/min 离心
15 min ；弃上清液，沉淀用 1 mL 75％乙醇清洗；10 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，沉淀室温干燥
5 min ；加 20 μL DEPC 水溶解 RNA 沉淀。-20 ℃冰箱保存备用，RNA 溶液应避免反复冻融，并尽快
用于检测。空白对照、阴性对照和阳性对照进行同步操作。
RNA 提取也可采用等效的商品化 RNA 提取试剂盒，代替以上方法。
8.3 cDNA 合成
8.3.1 变性和退火
反转录合成 cDNA 可选用等效的商品化试剂盒，下面以 Promega1）公司的反转录试剂盒（Reverse
Transcription System）进行 cDNA 合成。在 200 μL PCR 管中加入 10 μL RNA 模板，70 ℃孵育 10 min，
短暂离心后置于冰上。
8.3.2 cDNA 合成
在另一个 200 μL PCR 管中加入 MgCl2 2.5 μL 、反转录 10× 缓冲液 2.5 μL、dNTP 2.5 μL、重组的
Rnasina 核糖核酸酶抑制剂 0.5 μL、AMV 反转录酶 20 U、随机引物 1 μL、RNA 模板 4 μL，补充 DEPC
水至 25 μL。将反应体系在室温下温育 10 min，然后在 42 ℃下孵育 60 min。反应结束后，95 ℃ 5 min
灭活反转录酶，冰浴 5 min。
8.4 PCR 扩增 DNA
8.4.1 反应体系
普通 PCR 反应体系见表 1。PCR 扩增可以采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。
1） 使用 Promega 公司的反转录试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐 Promega 的产品，标准的使用
人可以使用其他公司的同类产品。
8.4.2 反应条件
将含有反应液的 PCR 管瞬时离心后，置于 PCR 仪。94 ℃预变性 7 min ；94 ℃ 变性 30 s，56 ℃
退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，35 个循环；72 ℃ 延伸 7 min ；4 ℃保存。
8.4.3 琼脂糖凝胶电泳
用 TBE 电泳缓冲液配制 1.5 % 的琼脂糖，加热完全溶解后，制成凝胶平板。待冷却后，取下梳子，
将凝胶平板放入水平电泳槽，加入电泳缓冲液至充分没过凝胶面。将 8 μL PCR 产物和 2 μL 电泳加样
缓冲液混匀后加入凝胶孔中进行电泳。在电泳时设立 DNA 标准分子量 100 bp～600 bp Marker 作对照。
5 V/cm～8 V/cm 电泳约 50 min，当溴酚蓝到达凝胶块底部时停止电泳。
8.4.4 凝胶成像分析和测序
将 电 泳 完 毕 的 凝 胶 放 入 含 0.5 μg/mL EB（ 或 等 效 商 品 化 核 酸 染 料 代 替 EB） 溶 液 中 染 色
10 min～30 min 后，使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经 PCR 扩增并电泳后如出现大
小约 309 bp 的 DNA 片段，应对其切胶利用 DNA 纯化回收试剂盒回收后进行测序，也可直接送 PCR
产物进行测序，参考序列参见附录 B，同源性要达到 94% 以上方可判为阳性。
8.5 结果判定
经 PCR 扩增并电泳后阳性对照出现一条大小约 309 bp 的 DNA 片段，而阴性对照和空白对照无
条带时，试验成立。待检样品经 PCR 扩增并电泳后，如果出现大小约 309 bp 的核酸条带并经测序验
证者为 PRV 核酸阳性。无条带或条带的大小不是约 309 bp 的为 PRV 核酸阴性。
9 实时荧光 RT-PCR
9.1 核酸提取
同 8.2。
9.2 cDNA 合成
同 8.3。
9.3 实时荧光 PCR 扩增
9.3.1 反应体系
实时荧光 PCR 反应体系见表 2。实时荧光 PCR 扩增可以采用等效的商品化荧光定量 PCR 试剂盒。
9.3.2 反应程序
95 ℃预变性 5 min ；之后 95 ℃变性 15 s，61 ℃退火 30 s，收集荧光，共 40 个循环。同时设阳性
对照、阴性对......
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