路径: 主页 > SN/T > 第62页 > SN/T 5200-2020 | 标准编号 | SN/T 5200-2020 (SN/T5200-2020) | | 中文名称 | 穿山甲物种鉴定技术规范 | | 英文名称 | (Technical specification for identification of pangolin species) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.01 | | 字数估计 | 19,141 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5200-2020
Protocol for species identification of Manis Spp
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
代替 SN/T 1162-2002
中华人民共和国海关总署 发 布
2020-12-30 发布
2021-07-01 实施
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020 的规定起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、东北林业大学。
本文件主要起草人：吴绍强、吕继洲、林祥梅、袁向芬、王晓龙。
穿山甲物种鉴定技术规范
1 范围
本文件规定了中华穿山甲、马来穿山甲、印度穿山甲、南非穿山甲、大穿山甲、长尾穿山甲和
树穿山甲等物种的形态特征和 SYBR Green I 实时荧光 PCR 鉴定方法，以及根据 PCR 产物测序结果和
序列分析对比判定穿山甲物种种类的方法。
本文件适用于中华穿山甲、马来穿山甲、印度穿山甲、南非穿山甲、大穿山甲、长尾穿山甲和
树穿山甲及其产品的物种鉴定。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测。
3 术语、定义和缩略语
本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。
Cytb ：细胞色素氧化酶 b（cytochrome b）
DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）
dNTP ：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）
Real-time PCR ：实时荧光聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction）
SDS ：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）
4 形态特征
中华穿山甲、马来穿山甲、印度穿山甲、南非穿山甲、大穿山甲、长尾穿山甲和树穿山甲成体
典型形态特征见附录 A。
中华穿山甲、马来穿山甲、树穿山甲以及大穿山甲四种穿山甲鳞片典型形态特征见附录 B。
根据上述特征，可初步鉴别活体穿山甲或疑似穿山甲鳞片样品的物种种类，精确鉴定应进一步
核酸扩增、测序检测确定物种。
5 Real-time PCR 检测
5.1 仪器与设备
5.1.1 Real-time PCR 仪。
5.1.2 组织研磨器。
5.1.3 超净工作台。
5.1.4 制冰机。
5.1.5 高速冷冻离心机。
5.1.6 水浴锅。
5.1.7 台式小型离心机。
5.1.8 常规冰箱。
5.1.9 旋涡混匀器。
5.1.10 电泳仪。
5.1.11 凝胶成像系统。
5.1.12 微量可调移液器（10 μL、100 μL、1 000 μL）及配套吸头。
5.2 试剂与材料
5.2.1 无水乙醇。
5.2.2 蛋白酶 K（20 mmol/μL）。
5.2.3 50×TAE 电泳缓冲液：试剂配制见附录 C 中 C.1。
5.2.4 穿山甲的基因组 DNA 阳性对照：阳性材料制备见附录 C 中 C.2。
5.2.5 Tirs-Hcl 缓冲液：试剂配制见附录 C 中 C.3。
5.2.6 生理盐水（0.85%NaCl 溶液）：试剂配制见附录 C 中 C.4。
5.2.7 EDTA 溶液：试剂配制见附录 C 中 C.5。
5.2.8 TES 缓冲液：试剂配制见附录 C 中 C.6。
5.2.9 10% SDS 溶液：试剂配制见附录 C 中 C.7。
5.2.10 氯化钠。
5.2.11 三氯甲烷。
5.2.12 异戊醇。
5.2.13 冰乙酸。
5.2.14 Tris-饱和酚。
5.2.15 70% 乙醇。
5.2.16 SYBR Premix Ex Taq 酶 1）。
5.2.17 灭菌双蒸水：应符合 GB/T 6682 中一级水的规格：见附录 C 中 C.8。
5.3 引物对
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合 GB/T 6682、GB 19489 的规定。
1） TAKARA 宝生物公司 SYBR 荧光定量试剂盒是适合的市售产品的实例。给出这一信息是为了方便本标准的
使用者，并不表示对这一产品的认可。
5.4 检测方法
5.4.1 样品的处理
5.4.1.1 直接取新鲜的、冷藏的或冷冻的样品 200 μL 用于核酸提取。
5.4.1.2 使用生理盐水（5.2.6）洗去血污，取 100mg～200 mg 样品置于液氮中充分研磨，将所研磨的粉
末放入 1.5 mL 的离心管中用于核酸提取。
5.4.2 样品 DNA 的提取
采用以下方法提取 DNA，也可使用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，按操作说明书进行操作。
5.4.2.1 取处理好的样品（5.4.1），加入 450μL TES 缓冲液（5.2.8）混匀后再加入 50 μL 10%SDS 溶液，
5 μL 蛋白酶 K（5.2.2），充分混匀后，于 56 ℃保温 4 h，每 2 h 摇 1 次。
5.4.2.2 加入等体积的 Tris- 饱和酚（500 μL），混匀。
5.4.2.3 取上层水相于新管，加入等体积的酚∶三氯甲烷（5.2.11）∶异戊醇（25: 24: 1）（试剂配制见
C.9）混匀，12 000 r/min 室温离心 5 min。
5.4.2.4 取上层水相于新管，加入等体积的三氯甲烷（5.2.11）混匀，12 000 r/min 室温离心 5 min。
5.4.2.5 取上层水相，加入 2.5 倍体积的无水乙醇（5.2.1），混匀，置于-20 ℃中 2 h 以上或过夜，
12 000 r/min 室温离心 15 min。
5.4.2.6 弃上清，加入 1 mL 预冷的 70% 乙醇（5.2.15），12 000 r/min 室温离心 5 min。
5.4.2.7 吸弃残留液体，室温干燥 10 min 左右，用 50 μL 灭菌双蒸水（5.2.17）溶解，-20 ℃保存备用。
5.4.3 SYBR Green I 实时荧光 PCR 扩增检测
5.4.3.1 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系
5.4.3.1.1 SYBR Premix Ex Taq 酶 （2×），12.5 μL。
5.4.3.1.2 MAF（20 pmol/μL），2.0 μL。
5.4.3.1.3 MAR（20 pmol/μL），1.0 μL。
5.4.3.1.4 样品 DNA 模板，1 μL。
5.4.3.1.5 灭菌双蒸水（5.2.17），3.5 μL。
总体积为 20 μL 体系，用漩涡混匀器进行混匀，瞬间离心，4℃备用。
注：可采用其他商品化的 SYBR Green I 实时荧光 PCR 的扩增试剂盒 2）。
样品检测时，同时要设阳性对照（5.2.4）和空白对照。阳性对照是已知的穿山甲提取的基因组
DNA（见附录 C 中 C.2），空白对照是灭菌双蒸水（5.2.17）。
5.4.3.2 SYBR Green I 实时荧光 PCR 程序及反应条件
反应参数为 95 ℃ 2 min，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火/延伸 30 s，40 个循环。在每一循环的退火/延
伸步骤 60 ℃结束时读取荧光信号；总延伸结束后，加入熔解曲线分析步骤（60 ℃，2min；以 0.1℃/s
的速率开温；直到 95 ℃ ；整个过程进行连续采集荧光。）
5.5 结果判定
5.5.1 实验成立的判定依据
在扩增动力学曲线图中，阳性对照可扩增出典型 S 型曲线，熔解曲线峰单一，扩增产物的 Tm 值
均一，典型曲线图见附录 D ；与此同时，阴性对照既无典型 S 型扩增曲线，也无溶解曲线峰。则阳
2） 如凯杰公司的 QuantiNDva SYBRGreen PCR Kit 荧光定量试剂盒。
性对照与阴性对照成立，SYBR Green I 实时荧光 PCR 成功。
5.5.2 疑似样本的判定依据
若样品出现典型 S 型扩增曲线，Ct 值 < 35，且溶解曲线峰单一且与阳性对照扩增产物 Tm 值相似，
则可判定样品中疑似含有穿山甲源性成分，后将扩增获得的 Cytb 序列进行测序；若样品 35 ≤ Ct 值
< 40，则重复实验，继续出现 35 ≤ Ct 值 < 40，且样品溶解曲线峰单一且与阳性对照扩增产物 Tm 值相
似，则可判定样品中疑似含有穿山甲源性成分，否则判定样品穿山甲源性成分阴性；若无目的条带，
判定样品穿山甲源性成分阴性。
5.5.3 穿山甲物种的判定
将测序获得序列与中华穿山甲、马来穿山甲、南非穿山甲、印度穿山甲、大穿山甲、长尾穿山
甲和树穿山甲 Cytb 参考序列（见附录 E）进行多重序列比对，如果与所获序列同源性最近的序列属
于中华穿山甲、马来穿山甲等 7 种穿山甲中的一种，且同源性达到 98% 以上时，可判定对应实验的
结果为阳性，进而确定检出中华穿山甲、马来穿山甲、南非穿山甲、印度穿山甲、大穿山甲、长尾穿
山甲或树穿山甲源性成分。
附 录 A
（规范性）
七种穿山甲形态特征概述
A.1 中华穿山甲形态特征概述
头体长 40 cm～55 cm，尾长 27 cm～33 cm，成体质量 3.1 kg～5.2 kg。尾长与头体长的百分比约
为 65%。后足长 64 cm，耳长 1.96 cm。头骨粗短，脑颅大，四肢粗壮，前后足各具 5 趾。
两颊、眼及喉不披鳞，而披以黄白或红棕色稀毛。全身披以覆瓦状排列的、像鱼鳞一般的硬角质
厚鳞片，在披鳞的部位各鳞片之间，还有黄棕色硬毛, 5～6 根成丛的伸出鳞外。胸腹平坦并且到尾基
下面以及四肢的内侧均不披鳞而覆以黄白色或红棕色的稀毛，绒毛......
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