[PDF] SN/T 5228.8-2019 - 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| SN/T 5228.8-2019 | 189 | SN/T 5228.8-2019 | <=3 | 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS法 第8部分:肺炎克雷伯氏菌 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5228.8-2019 (SN/T5228.8-2019) |
| 中文名称 | 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS法 第8部分:肺炎克雷伯氏菌 |
| 英文名称 | (Rapid screening method for pathogenic microorganisms in exported foods MALDI-TOF MS method Part 8: Klebsiella pneumoniae) |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C53 |
| 国际标准分类 | 67.050 |
| 字数估计 | 8,860 |
| 发布日期 | 2019 |
| 实施日期 | 2020-07-01 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5228.8-2019: 出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS法 第8部分:肺炎克雷伯氏菌
SN/T 5228.8-2019 英文名称: (Rapid screening method for pathogenic microorganisms in exported foods MALDI-TOF MS method Part 8: Klebsiella pneumoniae)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法 第 8 部分：肺炎克雷伯氏菌
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
SN/T 5228-2019《出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法》分为 9 个部分：
--第 1 部分：溶藻弧菌；
--第 2 部分：产气荚膜梭菌；
--第 3 部分：金黄色葡萄球菌；
--第 4 部分：克罗诺杆菌属；
--第 5 部分：创伤弧菌；
--第 6 部分：蜡样芽胞杆菌；
--第 7 部分：空肠弯曲菌；
--第 8 部分：肺炎克雷伯氏菌；
--第 9 部分：铜绿假单胞菌。
本部分为 SN/T 5228-2019 的第 8 部分。
本部分按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本部分起草单位：中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国北京海关。
本部分主要起草人：李可、方莹、沈飚、陆金虎、曾静、汪琦。
出口食品中病原微生物快速筛选方法 MALDI-TOF MS 法
第 8 部分：肺炎克雷伯氏菌
1 范围
SN/T 5228 的本部分规定了出口食品中肺炎克雷伯氏菌的 MALDI-TOF MS 快速筛选方法。
本部分适用于出口食品中肺炎克雷伯氏菌的快速筛选。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14926.13 实验动物 肺炎克雷伯杆菌检测方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
3 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BTS ：细菌检测标准品（bacterial test standard）。
CHCA ：α- 氰基 -4- 羟基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxy-cinnamic acid）。
MALDI-TOF MS ：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization
time-of-flight mass spectrometry）。
4 生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测肺炎克雷伯氏菌，所有培养物和废
弃物应参照 GB 19489 中的有关规定执行。
5 方法提要
MALDI-TOF MS 是应用于微生物全细胞快速检测的技术，主要依据微生物特征蛋白指纹图谱分析，
完成微生物的鉴定和分类。将待鉴定的菌落样品与适量的基质溶液点加在样品板上，溶剂挥发后形成
样品与基质的共结晶，利用激光作为能量来源辐射共结晶体，基质分子吸收能量与样品解吸附并使样
品电离，经过飞行时间分析器，将不同质荷比的离子分开，形成微生物特异性的质谱图。将待测微生
物质谱图与已知微生物的标准蛋白指纹图谱数据库进行比较，可以确定微生物的种属，进行微生物种
属鉴定。
6 试剂和材料
除有特殊说明外，所有试剂均使用色谱纯试剂。实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。
6.1 血琼脂平板。
6.2 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录 A 第 A.1 章。
6.3 胆硫乳琼脂（DHL）：见附录 A 第 A.2 章。
6.4 乙腈（ACN）。
6.5 无水乙醇。
6.6 甲酸。
6.7 三氟乙酸（TFA）。
6.8 CHCA。
6.9 BTS 标准品。
6.10 溶剂 I：按照水: 乙腈（6.4）: 三氟乙酸（6.7）为 50: 47.5: 2.5（体积比）的比例配制，现配
现用。
6.11 BTS 标准溶液的配制：用 50 µL 溶剂 I（6.10）溶解 BTS 标准品（6.9）。用移液器反复吹吸溶解
BTS 粉末（避免剧烈振荡），室温放置 5 min，再次溶解，待 BTS（6.9）全部溶解后，瞬时离心，用
200 µL PCR 管进行分装，每管 5 µL，-20℃保存备用。
6.12 CHCA 基质溶液的配制：在 CHCA（6.8）粉末中加入溶剂 I（6.10），使 CHCA 终浓度为 10 mg/mL。
振荡混匀，直至溶液澄清。用 1.5 mL 离心管进行分装，每管 50 µL，用封口膜密封管口，室温放置备用。
放置后，如出现大量沉淀应弃用。
7 主要仪器和设备
7.1 台式离心机：最大离心力≥ 16 000 g。
7.2 涡旋振荡器。
7.3 微量可调移液器和灭菌吸头：2 µL，100 µL，200 µL，1 000 µL。
7.4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪。
8 检测步骤
8.1 检测流程图
食品中肺炎克雷伯氏菌 MALDI-TOF MS 检测流程见图 1。
图 1 肺炎克雷伯氏菌 MALDI-TOF MS 检测流程图
8.2 样品制备、增菌培养
称取 25 g 样品至盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯内，8 000 r/min~10 000 r/min 均质 1 min~2 min，
或放入盛有 225 mL BPW 无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min~2 min。若样品为液态，吸取 25
mL 样品至盛有 225 mL BPW 的无菌锥形瓶 (瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀。于
36℃ ±1℃ 培养 18 h~24 h。
8.3 分离
将增菌后的培养物，划线接种于 DHL（6.3）平板上，于 36℃ ±1℃培养 18 h~24 h，观察各个平
板上生长的菌落形态。 在 DHL（6.3）平板上肺炎克雷伯氏菌菌落呈淡粉红色，大而隆起，光滑湿润，
粘液状，相邻菌落容易融合成脓汁样，接种针挑取菌落时呈丝状粘连。
8.4 可疑菌落的处理
可选用直接涂抹法或甲酸提取法任一方法进行可疑菌落处理。如果直接涂抹得不到高质量的图
谱，应继续选用甲酸提取法处理可疑菌落。
8.4.1 直接涂抹法
用牙签或 10 µL 枪头从选择性平板直接挑取可疑菌落，涂抹在靶板上，形成一均匀薄层（越薄越
好）。覆盖 1 μL CHCA 基质溶液（6.12），待 CHCA 基质溶液（6.12）干燥后进行 MALDI-TOF MS 检测。
8.4.2 甲酸提取法
8.4.2.1 接种培养
至少应挑取 5 个可疑菌落，划线接种血琼脂平板（6.1），36℃ ±1℃培养 18 h~24 h。如果平板上
的可疑菌落少于 5 个，则应全部挑取。
8.4.2.2 菌落蛋白提取
8.4.2.2.1 取适量细菌培养物（5 mg~10 mg），将细菌细胞重悬于 300 µL 水中，充分混匀；加入 900 µL
无水乙醇（6.5），涡旋振荡混匀；13 000 g，离心 2 min，弃上清，相同条件瞬时离心 30 s，用移液器移
除剩余上清液，室温放置 5 min，使乙醇挥发。
8.4.2.2.2 加入 30 µL~50 µL 70 % 甲酸（6.6）（甲酸的量可以根据细菌沉淀的量进行调整），充分混匀，
加入等体积乙腈（6.4），涡旋振荡混匀；13 000 g，离心 2 min，上清液用于点样。
8.5 点样
取 1 μL 8.4.2.2.2 中制备的上清液点到靶板上，同时在靶板上点 BTS 标准品（6.9），置室温，待
液滴干燥后，在样品上覆盖 1 μL CHCA 基质溶液（6.12），待 CHCA 基质溶液（6.12）干燥后进行
MALDI-TOF MS 检测。
8.6 MALDI-TOF MS 检测
8.6.1 仪器参数的设置
选择线性操作模式，正离子模式；检测范围：2 000 Da~20 000 Da；激光点击数：每图谱 40 次（6
次激光累积）；激光频率：60.0 Hz ；离子源加速电压：20 kV。
8.6.2 仪器校正
对可疑菌落进行质谱数据采集前，应先使用 BTS 标准品（6.9）对仪器的质荷比进行校准，确保
质荷比误差范围小于 0.030 0%。
8.6.3 数据采集及分析
对可疑菌落进行质谱数据采集并保存，通过 Biotyper 软件进行分析鉴定。
8.6.4 结果判定标......