路径: 主页 > SN/T > 第62页 > SN/T 5282-2020 | 标准编号 | SN/T 5282-2020 (SN/T5282-2020) | | 中文名称 | 虾偷死野田村病毒病检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical Specification for Quarantine of Virus Diseases in Notian Village) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 11.220 | | 字数估计 | 16,112 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5282-2020: 虾偷死野田村病毒病检疫技术规范
SN/T 5282-2020 英文名称: (Technical Specification for Quarantine of Virus Diseases in Notian Village)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
虾偷死野田村病毒病检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关，中国水产科学研究院黄海水产研究所。
本文件主要起草人：于力、张庆利、史秀杰、刘爽、王津津、郑晓聪、刘荭、黄倢。
虾偷死野田村病毒病检疫技术规范
1 范围
本文件规定了虾偷死野田村病毒病临床症状、组织病理、套式聚合酶链反应、实时荧光逆转录
聚合酶链反应和原位杂交的检测方法。
本文件适用于虾偷死野田村病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
SN/T 1193 基因检验实验室技术要求
3 术语、定义和缩略语
本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。
4 疾病概述
虾偷死野田村病毒病也叫虾病毒性偷死病，其病原为偷死野田村病毒（CMNV），属于野田村病
毒科（Nodaviridae）甲型野田村病毒属（Alphanodavirus），详细资料参见附录 A。
5 试剂和材料
5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格，用 DEPC 处理以除掉 RNase。PCR 实验应在符合 SN/T
1193 要求的实验室进行。
5.2 CMNV 病毒参考株。
5.3 Davidson’s AFA 固定液：见附录 B.1。
5.4 1% 盐酸乙醇：浓盐酸和 70% 乙醇配制。
5.5 梯度乙醇：70%、80%、95% 及无水乙醇。
5.6 二甲苯。
5.7 石蜡。
5.8 苏木精染液。
5.9 0.5% 伊红乙醇溶液。
5.10 中性树脂。
5.11 逆转录酶：20 U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。
5.12 RNase 抑制剂：20 U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。
5.13 Trizol 试剂：RNA 抽提试剂。
5.14 Taq 酶：-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。
5.15 dNTPs ：含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各 10 mmoL/L。
5.16 实时荧光 RT-PCR 的引物和探针的序列如下：
5.17 Nested PCR 引物序列
5.17.1 第一步引物序列如下：
5.17.2 第二步引物序列如下：
5.18 75% 乙醇：用无水乙醇和 DEPC 水配制，使用前预冷到-20℃。
5.19 氯仿。
5.20 异丙醇。
5.21 DNA 相对分子质量标准：分子量大小 100 bp~2000 bp 间的 DNA 片段，-20℃保存。
5.22 4% 多聚甲醛：多聚甲醛和 PBS 配制。
5.23 地高辛标记 RNA 探针，序列参见附录 C。
5.24 碱性磷酸酶偶联抗地高辛抗体：-20℃保存。
5.25 PBST ：含 0.1% 吐温-20 的 PBS。
6 器材和设备
6.1 切片机。
6.2 显微镜。
6.3 组织研磨器。
6.4 高速冷冻离心机。
6.5 实时荧光 PCR 扩增仪。
6.6 PCR 扩增仪。
6.7 水平电泳仪。
6.8 微量移液器。
6.9 凝胶成像仪。
7 临床症状
病虾多沉入水底，很少在水面活动，软壳，生长缓慢，很多情况下可见腹节肌肉发白。解剖可见
肝胰腺萎缩，空肠空胃。
8 检测方法
8.1 组织病理
8.1.1 取样和固定
取肝胰腺和肌肉组织，用 Davidson’s AFA 固定液固定 24 h。
8.1.2 脱水、包埋和切片
将固定好的组织用 70% 乙醇处理 1 h，80% 乙醇处理 1 h，95% 乙醇处理 1 h，无水乙醇处理 30
min（重复 2 次），二甲苯 + 无水乙醇（体积比 1∶1）处理 30 min，二甲苯处理 30 min（重复 2 次），
二甲苯 + 石蜡（体积比 1∶1）处理 15 min，石蜡处理 15 min（重复 2 次），石蜡包埋，切片，切片厚
度约 3 μm。切好的片子用于染色或者原位杂交。各步骤的时间可根据样品情况作适当调整。
8.1.3 染色
将切片用二甲苯处理 5 min（重复 2 次），二甲苯 + 无水乙醇（体积比 1∶1）处理 5 min，无水乙
醇处理 5 min，95% 乙醇处理 5 min，80% 乙醇处理 5 min，70% 乙醇处理 5 min，双蒸水洗涤，苏木
精染色，双蒸水洗涤，1% 盐酸乙醇处理，双蒸水洗涤，0.5% 伊红染色，双蒸水洗涤，70% 乙醇处理
5 min，80% 乙醇处理 5 min，95% 乙醇处理 5 min，无水乙醇处理 5 min（重复 2 次），二甲苯 + 无水
乙醇（体积比 1∶1）处理 5 min，二甲苯处理 5 min（重复 2 次），最后用中性树脂封固，显微镜下观察。
各步骤的时间可根据样品情况作适当调整。
8.1.4 结果判定
8.1.4.1 典型组织病理病变为：肝胰腺组织的肝胰腺小管上皮细胞中可见嗜酸性包涵体；肌肉组织
可见凝固状坏死，坏死肌纤维中有血细胞浸润，浸润血细胞的细胞核出现核固缩（参见附录 D）；
8.1.4.2 组织病理方法只用作初步判定。若检测样品中观察到典型病变，判定为可疑病例，需要用
本标准其他方法确诊。
8.2 Nested PCR
8.2.1 样品采集
按 GB/T 18088 的标准采样，优先选取具有临床症状的个体。取肝胰腺、鳃和附肢。
8.2.2 RNA 抽提
用组织研磨器制备组织匀浆，取匀浆成糊状的组织样品 25 mg ~ 100 mg 加入到 1.5 mL 离心管。
加入 1 mL Trizol，用枪头充分吹打均匀；加入 200 μL 三氯甲烷，涡旋振荡 30 s ；4℃ 12000 r/min 离心
15 min；取上层水相到新的1.5 mL离心管，加入500 μL异丙醇，上下颠倒数次混匀，静置10 min；4℃
12000 r/min 离心 15 min ；弃上清，沉淀物用 1 mL DEPC 水配制的 75% 乙醇洗涤；4℃ 8000 r/min 离
心 10 min ；弃上清，沉淀室温干燥 10 min ；加入 30 μL DEPC 水溶解 RNA 沉淀。提取后的 RNA 应尽
快用于逆转录合成 cDNA 模板。
具备同样抽提效率的商业化 RNA 抽提试剂盒也同样适用。
8.2.3 Nested PCR 第一步
8.2.3.1 反应体系和参数
在冰上配制体系，取 18.5 μL（总量约 150 ng ~ 200 ng）待测 RNA 溶液，加 10 倍逆转录酶浓缩缓
冲液（见附录 B.2）2.5 μL、dNTP 1 μL、RNase 抑制剂 1 μL、逆转录酶 1 μL、下游引物（CMNV-7R1）
1 μL。混匀后，置 PCR 仪上 50℃反应 30 min，95℃反应 10 min，-20℃保存 cDNA 模板。
在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液（见附录 B.3）2.5 μL、
dNTPs 0.5 μL、Taq 酶 0.5 μL、上游引物（CMNV-7F1）和下游引物（CMNV-7R1）各 0.5 μL、双蒸水
18 μL、cDNA 模板 2.5 μL，配制反应体系。同时设置不含 cDNA 模板的空白对照、阳性对照和阴性对
照，检测体系配制方法相同。95℃ 4 min ；95℃ 30 s，45℃ 30 s，72℃ 40 s，35 个循环；72℃ 7 min，
4℃保存。
具有同样扩增效率的商业化 RT-PCR 试剂盒也同样适用。
8.2.3.2 电泳和产物测序
用 TBE 电泳缓冲液（见附录 B.4）配制 1.5% 的琼脂糖平板（含 1 μg/mL EB）。将平板放入水平电
泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将 6 μL 扩增产物和 2 μL 溴酚蓝指示剂溶液（见附录 B.5）混匀
后加入孔内。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。5 V/cm 电泳约 0.5 h，当溴酚兰到达琼脂
糖凝胶的底部时停止。
用紫外照射仪或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。若阳性对照出现一条 619 bp 的目标条带，
阴性对照和空白对照没有该条带，实验有效；若样品出现目标条带，进行测序确认；若样品无条带，
需进行 Nested PCR 第二步。
8.2.4 Nested PCR 第二步
8.2.4.1 反应体系和参数
在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液 2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、
Taq 酶 0.5 μL、上游引物（CMNV-7F2）和下游引物（CMNV-7R2）各 0.5 μL、双蒸水 18 μL，Nested
PCR 第一步扩增产物 2.5 μL，配制反应体系。同时设置不含模板的空白对照、阳性对照和阴性对照，
检测体系配制方法相同。95℃ 4 min ；95℃ 20 s，50℃ 20 s，72℃ 20 s，30 个循环；72℃ 7 min，4℃
保存。
具有同样扩增效率的商业化 PCR 试剂盒也同样适用。
8.2.4.2 电泳和产物测序
方法见 8.2.3.2，目标条带大小为 165 bp。
8.2.5 结果判定
8.2.5.1 若 Nested PCR 第一步或第二步出现目标条带，测序结果与参考序列（参见附录 E）同源性
大于或等于 95%，判定为阳性；
8.2.5.2 若未出现相应大小的目标条带，或序列同源性小于 95%，判定为阴性。
8.3 实时荧光 RT-PCR
8.3.1 样品采集和 RNA 抽提
方法见 8.2.1 和 8.2.2。
8.3.2 反应体系和参数
逆转录方法见 8.2.3.1，使用下游引物（CMNV-Taq-R）。
在 0.2 mL PCR 薄壁管或八联管中，按每个样品 10 倍 Taq 酶浓缩缓冲液 2.5 μL、dNTPs 0.5 μL、
Taq 酶 0.5 μL、上游引物（CMNV-Taq-F）和下游引物（CMNV-Taq-R）各 0.5 μL、探针 0.5 μL、双蒸
水 17.5 μL、cDNA 模板 2.5 μL，配制反应体系。同时设置不含 cDNA 模板的空白对照、阳性对照和阴
性对照，检测体系配制方法相同。95℃ 5 min ；95℃ 15 s，53℃ 35 s（收集荧光信号），40 个循环。
具有同样扩增效率的商业化一步法荧光 RT-PCR 试剂盒也同样适用。
8.3.3 结果判定
8.3.3.1 若阳性对照出现典型扩增曲线且 Ct 值小于或等于 35，阴性对照和空白对照无扩增曲线，实
验有效；
8.3.3.2 若检测样品出现典型扩增曲线且 Ct 值小于或等于 35，判定为阳性；若检测样品无扩增曲线，
判定为阴性；
8.3.3.3 若检测样品的 Ct 值大于 35 而小于 40 时，应增加模板浓度重新进行检测。重新检测 Ct 值大
于 35，判定为阴性；出现典型扩增曲线且 Ct 值小于或等于 35，判定为阳性。
8.4 原位杂交
8.4.1 操作步骤
8.4.1.1 制作组织切片方法见 8.1.1 和 8.1.2，按 8.1.3 用二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡水化处理。
8.4.1.2 4% 多聚甲醛固定 10 min，PBS 洗涤 3 次。0.2 mol/L HCl 处理 10 min，PBST 洗涤 3 次。10
μg/mL 蛋白酶 K 消化 10 min，PBST 洗涤 3 次。
8.4.1.3 加入杂交液（见附录 B.8），70℃预杂交 2~5 h。加入含适量地高辛标记 RNA 探针的杂交液，
70℃过夜。
8.4.1.4 在 70℃，洗涤液（见附录 B.9）洗涤 2 次，2×SSC 洗涤 2 次，0.2×SSC 洗涤 2 次。室温用
MAB（见附录 B.10）洗涤 1 次。用封闭液（见附录 B.11）封闭 4 h，加入适当浓度的碱性磷酸酶偶联
抗地高辛抗体，4℃过夜。
8.4.1.5 PBST 洗涤 6 次，加入 BCIP/NBT 底物溶液放置黑暗处显色，注意观察样品的颜色变化。待
样品的显色达到理想着色后，PBST 洗涤 5 次终止反应，显微镜下观察。同时设置阳性对照和阴性对
照。各步骤的时间可根据样品情况作适当调整。
8.4.2 结果判定
8.4.2.1 若阳性对照观......
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