[PDF] SN/T 5334.1-2020 - 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| SN/T 5334.1-2020 | 179 | SN/T 5334.1-2020 | <=3 | 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第1部分：通用要求与定义 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | SN/T 5334.1-2020 (SN/T5334.1-2020) |
| 中文名称 | 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第1部分：通用要求与定义 |
| 英文名称 | (Digital PCR detection method for genetically modified plant products - Part 1: General requirements and definitions) |
| 行业 | 商检行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | B16 |
| 国际标准分类 | 65.020.01 |
| 字数估计 | 8,868 |
| 发布日期 | 2020-12-30 |
| 实施日期 | 2021-07-01 |
| 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 |
| 发布机构 | 海关总署 |
SN/T 5334.1-2020: 转基因植物产品的数字PCR检测方法 第1部分：通用要求与定义
SN/T 5334.1-2020 英文名称: (Digital PCR detection method for genetically modified plant products -- Part 1: General requirements and definitions)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
转基因植物产品的数字 PCR 检测方法 第 1 部分：通用要求和定义
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
SN/T 5334-2020《转基因植物产品的数字 PCR 检测方法》共分为 8 个部分：
--第 1 部分：通用要求及定义
--第 2 部分：转基因大豆；
--第 3 部分：转基因玉米；
--第 4 部分：转基因油菜；
--第 5 部分：转基因棉花；
--第 6 部分：转基因马铃薯；
--第 7 部分：转基因苜蓿；
--第 8 部分：转基因甜菜。
本文件为 SN/T 5334-2020 的第 1 部分。
本文件按照 GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国南宁海关技术中心、中华人民共
和国广州海关技术中心。
本文件主要起草人：付伟、朱鹏宇、杜智欣、魏霜、王晨光、郑明慧、朱水芳、黄文胜。
转基因植物产品的数字 PCR 检测方法
第 1 部分：通用要求和定义
1 范围
本文件规定了转基因植物产品的转基因成分数字 PCR 检测方法的范围、规范性引用文件、缩略
语、术语和定义、原理、方法建立步骤、结果判定和样品保存的内容。
本文件适用于转基因植物产品中转基因成分数字 PCR 定量检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义
GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求
GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法
GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法
3 术语和定义
下列术语和定于适用于本文件。
4 原理
数字 PCR 是在荧光 PCR 基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝
数的测定。通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热 DNA 复制酶及其缓冲液的荧光 PCR 反应体系充
分混匀，等量均分为相互隔离的大数量（大于 10 000 个）微反应体系，使每个模板独立随机地分配
至微反应体系中；所有微反应体系同时在相同的规定条件下进行 PCR 扩增反应，根据设定的荧光阈
值判断每个微反应体系的扩增结果；依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字 PCR 反
应体系中的模板浓度。
5 仪器设备、试剂及耗材
5.1 仪器设备
5.1.1 分析天平：感量 0.1 mg。
5.1.2 生物安全柜（超净工作台）。
5.1.3 数字 PCR 系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其
它具有同样功能的仪器。
5.1.4 PCR 扩增仪。
5.1.5 恒温孵育器：控温精度 ±1.0 ℃。
5.1.6 样品粉碎机：可将棉籽、棉籽粕等样品磨成 60 目左右的粉末。
5.1.7 微量移液器：100 μL~1 000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL、0.1 μL~2.5 μL。
5.1.8 重蒸馏水发生器或纯水仪。
5.1.9 涡旋振荡仪。
5.1.10 核酸检测仪：核酸/蛋白含量测定分光光度计、微量分光光度计或其他核酸检测仪。
5.1.11 离心机：离心力≥ 12 000 g。
5.2 试剂及耗材
除非有特殊说明，试剂和材料质量应符合 GB/T 19495.1 的要求。重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定
的一级水要求。
5.2.1 CTAB 法基因组提取试剂或等效的 DNA 提取试剂盒。
5.2.2 数字 PCR 微反应体系生成联排管及覆膜或芯片。
5.2.3 96 孔荧光定量 PCR 反应板和封膜。
5.2.4 0.2 mL 和 1.5 mL 离心管。
5.2.5 数字 PCR 反应预混液：含有镁离子、dNTPs 和具有 5’-3’ 外切活性的热启动 Taq 酶及缓冲液的
数字 PCR 专用预混试剂。
6 一般性操作步骤
6.1 抽样
按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19495.7 的规定执行。
6.2 制样
按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19495.7 的规定执行。
6.3 试样预处理
按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19495.3 的规定执行。
6.4 DNA 模板制备
按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19495.3 的方法或采用具有相同效果的植物基因组 DNA 提取试剂盒进行
DNA 提取。提取后的 DNA 用紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 处吸收值，分别计算核酸的纯度
和浓度：DNA 纯度以 OD260/OD280 表示，该值应在 1.7~1.9 ；DNA 浓度 =50×OD260 mg/mL，浓度不低于
20 ng/L。
7 方法建立步骤
7.1 一般性要求
检测样品中 DNA 的提取和含量测定应按照 GB/T 19495.3 的规定执行。对样品进行 DNA 提取时
要保证 DNA 的质量和浓度的稳定，以保证数字 PCR 反应的稳定性和可重复性。检测样品 DNA 进行
数字 PCR 检测时需要进行平行实验。
数字 PCR 反应体系中包括数字 PCR 扩增预混液、外源基因以及内标准基因的引物和探针、DNA
模板和水。其中数字 PCR 扩增预混液终浓度为 1×，外源基因与内标准基因引物终浓度在 0.3 μmol/L ~
1 μmol/L，探针终浓度在 0.15 μM ~0.5 μM，DNA 模板的量在 10 ng ~100 ng。反应程序根据不同引物探针
以及扩增片段而不同，退火温度在 55 ℃ ~65 ℃，延伸之间根据片段长度而定。
7.2 数字 PCR 反应设计
7.2.1 引物探针要求
7.2.1.1 引物设计原则
引物设计应遵循以下原则：
a） 引物设计以各个品系的转化事件特异性序列为模板设计。与常规定量 PCR 类似，要求扩增片
段需要小于 200 bp，最短不得低于 50 bp ；
b） 用于进行数字 PCR 定量的引物序列长度应该在 15 bp ~30 bp，所使用探针长度应在 20 bp ~35 bp ；
c） 引物、探针中的 GC 含量应该在 40%~60% ；
d） 数字 PCR 引物 Tm 值应在 55 ℃ ~65 ℃ ；探针 Tm 值应在 65 ℃ ~75 ℃。
7.2.1.2 引物的验证
引物的验证如下：
a） 引物、探针的验证需要分为两步，首先为理论特异性验证，其次为实验特异性验证；
b） 理论性评价至少应该在一个主要的核酸序列数据库（如 GenBank 等）里面进行 Blast 序列同
源性比对，评价其他生物体中是否具有该引物的同源序列；
c） 实验特异性验证主要确认该引物探针在其他转基因品系的交叉扩增反应情况。
7.2.2 数字 PCR 方法验证
对建立的数字 PCR 方法，在实验室内进行确认时，应达到以下要求：
a） 精密度（重复性的相对标准偏差 RSDr）：线性动态范围内的重复性相对标准偏差 RSDr 一般应
≤ 25％ ；
b） 正确度：在整个线性动态范围内，用正确度表示多次测试的均值与采纳的标准值之间的接近
程度，且偏差不应超过标准值的 25% ；
c） 再现性：由两个不同操作人员，在两个不同时间段，对不同质量分数的样品（包括目标浓度
样品、检出限样品、定量限样品和阴性样品）进行测试。若全部测试样品的测试结果与预期
一致，表明方法再现性符合要求。否则，重新进行相关测试。
7.2.3 质控组
数字 PCR 反应需设立至少包括一个标准参照样品质控组、一个阴性质控组和一个空白试剂质控
组，质控组的设置应符合 GB/T 19495.1 的规定。
8 结果判定
8.1 结果计算
8.1.1 体系中......