路径: 主页 > MISC > 第351页 > WS 216-2018 | 标准编号 | WS 216-2018 (WS216-2018) | | 中文名称 | 登革热诊断 | | 英文名称 | Diagnosis for dengue fever | | 行业 | 卫生行业标准 | | 中标分类 | C59 | | 字数估计 | 25,220 | | 发布日期 | 2018-03-06 | | 实施日期 | 2018-08-01 | | 旧标准 (被替代) | WS 216-2008 | | 标准依据 | 国卫通(2018)4号 | | 发布机构 | 卫生健康委员会 | WS 216-2018: 登革热诊断
WS 216-2018 英文名称: Diagnosis for dengue fever
ICS 11.020
C 59
WS
中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准
代替 WS 216-2008
登革热诊断
1 范围
本标准规定了登革热的诊断依据、诊断原则、诊断和鉴别诊断。
本标准适用于各级各类医疗卫生机构及其医务人员对于登革热病例的诊断。
5 诊断
5.1 疑似病例
符合下列一项可诊断为疑似病例：
a) 符合 3.1，并同时符合 3.2.1。
b) 同时符合 3.2.1、3.3.1。
5.2 临床诊断病例
符合下列一项可诊断为临床诊断病例：
a) 符合 5.1a），并同时符合 3.2.2、3.2.3中任一项和 3.3.1。
b) 符合 5.1，并同时符合 3.3.2、3.3.3中任一项。
5.3 确诊病例
符合5.1或5.2，并同时符合3.3.4、3.3.5、3.3.6中任一项可诊断为确诊病例。
5.4 重症登革热
符合5.2或5.3，并同时符合3.2.4、3.2.5、3.2.6中任一项可诊断重症登革热。
6 鉴别诊断
登革热应与麻疹、风疹、猩红热、流行性感冒、基孔肯雅热、寨卡病毒病相鉴别；重症登革热应与
钩端螺旋体病、肾综合征出血热、恙虫病等相鉴别。参见附录C与附录D。
A A
附 录 A
（规范性附录）
登革热血清学检测方法
A.1 应用IgM捕捉酶联免疫吸附试验（Mac-ELISA）检测登革病毒IgM抗体
A.1.1 原理
根据抗原抗体特异性结合的原理，利用抗人μ链单克隆抗体捕获待检测血清中的IgM，再加入特异
性抗原和相应酶标单克隆抗体，加底物显色。显色程度与特异性IgM抗体含量呈正相关。
A.1.2 材料和试剂
所需材料和试剂如下：
a) 洗板机、酶标仪、恒温温箱或水浴箱（37℃±2℃）；
b) 10μL～100μL可调移液器、10mL吸管；
c) 稀释血清用的试管、吸水纸；
d) 蒸馏水或去离子水；
e) 登革病毒 IgM 抗体捕捉 ELISA诊断试剂盒。
A.1.3 检测方法
具体步骤如下：
a) 在一系列试管中，将阴、阳性对照血清，临界值较准血清和待检血清稀释成 1∶100；
b) 吸取所需量的纯化登革病毒抗原和等体积辣根过氧化物酶标记单克隆抗体至另一干净的玻璃
瓶或试管中，混匀后置室温作用 1h；
c) 混合好标记单克隆抗体和抗原后，在 10min 内各吸取 100μL 稀释好的病人标本和对照血清至
测试板上相应的微孔中，37℃作用 1h；
d) 弃血清，用洗涤液重复洗涤 6 次，吸水纸上扣干，分别加 100μL上述作用好的登革病毒抗原
和酶标单克隆抗体复合物，37℃作用 1h；
e) 弃登革病毒抗原和酶标单克隆抗体复合物，用洗涤液重复洗涤 6次，吸水纸上扣干，每孔加入
100μL的 TMB（四甲基联苯胺），室温作用 10min充分显现蓝色后，每孔加入 100μL 的终止液，混匀；
f) 在 30min内于 450nm波长处读取每孔的吸光度。
A.1.4 结果判断
A.1.4.1 酶标仪读数结果判断
判断标准为：在NC/CO＜1且PC/CO＞1的情况下，若S/CO＜0.9，则结果为阴性，若S/CO＞1.1，则结
果为阳性，若S/CO＝0.9～1.1，则标本需重做。
注：S为待检血清的吸光度；NC为阴性对照血清的吸光度；PC为阳性对照血清的吸光度；
CO为临界较准血清的吸光度平均值。
A.1.4.2 目测法
未加终止液前，在阳性对照血清为深蓝色、阴性对照血清为无色的情况下，若样品孔的颜色比临界
较准血清孔深者为阳性，样品孔的颜色比临界较准血清孔浅者为阴性。
A.1.5 意义
IgM抗体阳性，表示患者新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断。
A.2 应用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测登革病毒IgM抗体
A.2.1 原理
根据抗原抗体特异性结合的原理，用纯化的登革病毒基因工程表达抗原包被塑料板，与稀释的待检
血清中的特异性抗体结合，其中血清IgM部分又与后加入的酶标记的抗人IgM结合，通过酶与底物的作用
产生可见的颜色反应，显色程度与特异性IgM抗体含量呈正相关。
A.2.2 材料和试剂
所需材料和试剂如下：
a) 洗板机、酶标仪、恒温温箱或水浴箱（37℃±2℃）；
b) 10μL～100μL可调移液器、10mL吸管；
c) 稀释血清用的试管、吸水纸；
d) 蒸馏水或去离子水；
e) 登革病毒 IgM 抗体酶联免疫诊断试剂盒。
A.2.3 检测步骤
具体步骤如下：
a) 将检测血清用样品稀释液做 1∶50 稀释。（先将 10μL 血清加入到 90μL 的样品稀释液中混
匀，再将 1∶10的稀释血清用样品稀释液做 1∶5稀释充分混匀。标本稀释后应在 2h内使用。）
b) 将浓缩洗涤液加入 720mL（96T）蒸馏水中混匀备用。
c) 取出已包被板，加入已稀释血清 100μL/孔，同时设阴、阳性对照及空白对照各 2孔（阴、阳
性对照孔分别直接加入相应对照血清 100μL/孔，空白对照加入洗涤液 100μL/孔），振荡均
匀后，于 37℃水浴箱温育 40min。
d) 温育后，甩去板内液体，用洗涤液注满各孔，静置 1min后甩干，重复洗涤 5次，扣干。
e) 加入酶标记物 50μL/孔（空白孔不加），振荡均匀后，于 37℃水浴箱温育 30min。
f) 温育后，甩去板内液体，用洗涤液注满各孔，静置 1min后甩干，重复洗涤 5次，扣干。
g) 每孔加入底物 A、B 液各 50μL，37℃避光显色 10min，再加入终止液 50μL/孔，于 450nm 测OD值。
A.2.4 结果判断
临界值（cut-off）=0.2+阴性对照均值（N＜0.05 时，按0.05计算）。
样品OD值大于临界值为阳性，样品OD值小于临界值为阴性。样品OD值在临界值正负10％范围内为可
疑，建议用其他方法复试。
A.2.5 意义
IgM抗体阳性，表示患者新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断。
A.3 酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原方法
A.3.1 原理
在微孔条上预包被登革病毒的单克隆抗体，该抗体可与登革热病例血清中的登革病毒中的NS1抗原
特异性结合，再与辣根过氧化酶标记抗NS1抗体试剂进行第二次温育，当样品中存在登革病毒NS1抗原时
将形成“包被抗体-NS1-酶标抗体”复合物。加入显色剂，复合物上连接的辣根过氧化物酶催化显示剂
反应，生成蓝色产物，终止反应后，变为黄色，若样品中无登革病毒NS1抗原则不显示。
A.3.2 材料
10μL，100μL，200μL，1mL移液器各一把；温箱一台，洗板机一台，酶标仪一台。稀释血清用的
试管、吸水纸；蒸馏水或去离子水；登革病毒NS1抗原酶联免疫诊断试剂盒。
A.3.3 检测步骤
具体步骤如下：
a) 将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡 30min，使用前将试剂轻轻振荡混匀；
b) 配液：将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水 20倍稀释；
c) 编号：将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照 3孔，阳性对照 2孔和空白对照 1孔；
d) 加稀释液：每孔加稀释液 50µL，空白孔除外；
e) 加样：分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各 50µL，空白孔除外；
f) 温育：用封板膜封板后，置 37℃温育 60min；
g) 每孔加酶标试剂 50µL，空白孔除外，轻轻振荡混匀；
h) 温育：用封板膜封板后，置 37℃温育 30min；
i) 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤 5遍，最后 1次尽量扣干；
j) 显色：每孔加入显色剂 A、B液各 50µL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色 15min；
k) 测定：每孔加终止液 50µL，10min 内测定结果。设定酶标仪波长于 450nm 处［建议使用双波
长 450nm/（600～650）nm检测］，用空白孔调零后测定各孔 A值。
A.3.4 结果判定
临界值计算：临界值=0.10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0.05者以0.05计算）。
阴性对照的正常值范围：阴性对照孔A≤0.1（若1孔A＞0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照＞
0.1，应重复实验）。
阳性对照正常值范围：A≥0.8。
阳性判定：样品A值≥临界值者为登革病毒抗原阳性。
阴性判定：样品A值＜临界值者为登革病毒抗原阴性。
A.3.5 意义
阳性结果表示患者新近存在登革病毒感染，适用于登革热早期诊断。
A.4 用免疫荧光法（FA/IFA）检测登革病毒IgG抗体
A.4.1 原理
某些荧光素（常用异硫氰酸荧光素）能与抗体蛋白分子结合，而不丧失抗体活力，仍能和相应的抗
原发生特异免疫反应，产生免疫复合物，这种复合物由于有荧光色素的参与，在荧光显微镜下显示荧光，
表明有特异性抗原存在。直接免疫荧光法可用于检测感染细胞内的特异性抗原，间接免疫荧光法可查待
检血清中的特异性抗体。
A.4.2 仪器与试剂
所需仪器与试剂如下：
a) 10μL～100μL，100μL～1000μL可调移液器各 1支；
b) 登革病毒 1～4 型抗原片（登革标准毒株感染 BHK、Vero或 C6/36 细胞制备，低温干燥保存）
及相应单克隆抗体（阳性对照）、阴性血清；
c) 羊抗人（兔抗人）IgG荧光抗体；
d) 待检患者血清（急性期和恢复期）；
e) 常用稀释液：pH7.2～7.4PBS、伊文斯兰、封片胶等；
f) 荧光显微镜。
A.4.3 检测步骤
具体步骤如下：
a) 取出抗原片，冷风吹干；
b) 用 pH7.2～7.4PBS 稀释待检血清，从 1∶20开始，对倍稀释至所需稀释度；
c) 用移液器依次从高稀释度向低稀释度逐个加入稀释的待检血清于四个型的登革病毒抗原片孔
中，每型各加 2孔待检系列稀释血清，血清量以完全覆盖抗原面而不溢出孔外为准，置湿盒内，
在 37℃水浴孵育 30min（每次试验同时作阴、阳性对照）；
d) 用 pH7.2～7.4PBS 漂洗 3次，每次约 30s～1min，再用蒸馏水洗 1次，冷风吹干；
e) 用 pH7.2～7.4PBS 稀释荧光抗体，使其内含 2个工作单位和 1∶8000伊文斯兰的荧光抗体，加
入各孔中，使完全覆盖抗原面，置湿盒中，37℃水浴作用 30min，取出，同上漂洗及吹干；
f) 用封片胶（或甘油缓冲液）封片，荧光显微镜观察结果。
A.4.4 结果判断
特异性荧光呈黄绿色颗粒，分布在感染细胞浆中。根据荧光亮度和阳性细胞在细胞总数中所占的比
例可将荧光反应大致区分为“+～++++”，无荧光者为“-”。检测抗体滴度时，以特异荧光达“++”
最高血清稀释度的倒数表示。
A.4.5 意义
阳性结果只能说明受检者可能曾存在登革病毒感染，但血清抗体效价达1∶80或以上者有诊断参考
意义，若恢复期血清抗体效价比急性期血清抗体效价有4倍或以上增长可确诊最近存在登革病毒感染。
A.5 中和试验（NT）
A.5.1 原理
当人体感染登革病毒后，血清中可产生保护性的中和抗体，登革病毒与这种特异性抗体作用后，能
被特异性地“中和”，抑制登革病毒的复制与繁殖，使其失去感染能力。中和试验包括动物中和试验、
组织培养中和试验和空斑减少中和试验三种，每种中和试验又分为固定病毒稀
释血清法和固定血清稀释病毒法两种。
动物中和试验由于需要特殊的感染动物房，一般的实验室很难做到，所以更多的实验室采用的是组
织培养中和试验和空斑减少中和试验，其中空斑减少中和试验比组织培养中和试验更敏感、特异，但由
于前者对操作技术的要求更高，而且病毒噬斑小，出斑时间长，对细胞覆盖培养基的要求也高，故一般
实验室多用的是组织培养中和试验。
A.5.2 仪器与试剂
所需仪器与试剂如下：
a) 50μL～200μL、1mL可调移液器，200μL、1mL无菌吸头；
b) 无菌细胞吹打管、吸管；
c) 无菌平底微量 96孔组织培养板；
d) 无菌 1.5mL 塑料离心管、冰盒；
e) 登革病毒 1～4型标准毒株、C6/36细胞、阳性和阴性对照血清；
f) CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜；
g) 生长液（200mL）：Eagle's MEM溶液 174mL，3％谷氨酰胺 2mL，1万单位青链霉素 2mL，7.5％
碳酸氢钠 2mL，新生小牛血清 20mL，临用前配制混匀；
h) 维持液的配制（200mL）：Eagle's MEM溶液 190mL，3％谷氨酰胺 2mL，1万单位青链霉素 2mL，
7.5％碳酸氢钠 2mL，新生小牛血清 4mL，临用前配制混匀。
A.5.3 检测步骤
A.5.3.1 病毒滴度测定
具体步骤如下：
a......
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