路径: 主页 > MISC > 第347页 > WS/T 360-2011 | 标准编号 | WS/T 360-2011 (WS/T360-2011) | | 中文名称 | 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南 | | 英文名称 | Guidelines for peripheral lymphocyte subsets by flow cytometry | | 行业 | 卫生行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C50 | | 国际标准分类 | 11.020 | | 字数估计 | 23,251 | | 发布日期 | 2011-12-14 | | 实施日期 | 2012-06-01 | | 标准依据 | 卫通(2011)22号;行业标准备案公告2012年第2号(总第146号) | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 | | 范围 | 本标准规定了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群(T细胞、B细胞、NK细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞)的技术要点, 包括标本采集和运输、免疫荧光染色技术、流式细胞仪检测和分析、结果报告和审核等方面。 | WS/T 360-2011
Guidelines for peripheral lymphocyte subsets by flow cytometry
中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准
中华人民共和国卫生部 发 布
2011-12-14 发布
2012-o6-o1 实施
本标准按照 GB/T 1.1-2009给 出的规则起草。
本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。
本标准主要起草单位:中 国医学科学院北京协和医院。
本标准主要起草人:崔 巍、黄春梅、王斐、杨卓、陈倩 。
流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南
l 范围
本标准规定了流式 细胞 术 检测外 周 血淋 巴细胞 亚群 (T细 胞 、B细 胞 、NK细 胞 、CDl T细胞 和
CD8+T细 胞)的技术要点,包括标本采集 和运输 、免疫荧光染色技 术 、流式 细胞仪检测 和分析 、结果报
告和审核等方面 。
2 术语和定义
下列术语和定 义适用 于本文件 。
2.1
分化抗原
不同谱 系细胞在分化 、成熟 、活化过程 中,出 现或消失的细胞表面标 志 。细胞表面标 志通常用单克
隆抗体来识别。每个抗体都有指定 的 CD编号,能 被特定抗体识别的特定抗原通常具有相 同的编号,例
如,被 “CD1抗体”识 别的抗原称为“tlDl抗原”。
2.2
目亍向散身寸光
光学检测器在人射光的正前方所收集的低角度光信号,勹 细胞或颗粒 的大小和体积有关。
2.3
侧 向散射光
光学检测器在人射光的直角处所收集 的细胞散射 的光信号,与 细胞或颗粒 的内部和表 面结构复杂
程度有关,如 细胞质颗粒性 、膜不规则性及核形等 。
2.4
亥乏爿‘强店芰
结合到细胞或颗粒上 的荧光素 的量 。荧光信号 的通道数越大提示荧光强度越强 。在恰 当的条件
下,荧 光强度与一个细胞和特定荧光素相结合的位点数相关 。
2.5
自发荧光
未染色细胞 白身发出的荧光 。通常 由嘧啶和黄素核苷酸所产生,白 发荧光 的强度取决 于激发光 的
波长,且 随所分析细胞 的类型和 (或)细 胞活化状态而改变 。通过特殊 的标本 处理方法可 以降低 白发荧
光的强度。
2.6
颜色补偿 coIor compensation
由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射 的波长范围内而造成荧光佶号重叠,通 过在其
他荧光信 弓巾扣除已测定荧光信 号的一部分而纠正颜色重叠造成的计数错误 。扣除的荧光量是用恰 当
的单染对照来确定的.被校正 的信 号反映了单荧光信 号的发射情况 。
2.7
以芝门 gate
在流式细胞仪显示 的象限图上基于一组参数 (女口荧光对 sSC.「sC/sSC等)来确定 的所要 分析的 目
的细胞群.又寸限定 区内的 目的细胞群通过其他参数 (如 荧光参数)进一步分析其表达情况 。
2.8
双平 台方法
用于流式细胞术测定细胞绝对计数的一种方法,结果来源于流式细胞仪 和第二种仪器 的检测 。第
二种仪器通常是血细胞分析仪 。流式细胞仪用 于获取 出现于较多量靶细胞群 中的 目的细胞亚群 的 比
例,靶细胞群通常是淋 巴细胞群或 白细胞群 。用第工种仪器分析 同一标本靶细胞群的绝对浓 度 ε这两
个测定结果相乘 所得 即为 目的细胞群的绝对浓度 。该方法 的缺点是包含两种体 系的系统误差 。
2,9
单平台方法
用于流式细胞术测定细胞绝对浓度 的一种方法,所有结果均来 自流式细胞仪一 台仪器 的测定 。浓
度的测定可 以直接通过测定体积的方法或问接的通过加入 已知浓度的荧光微球来计算 。单平 台方法免
去了第二 台仪器 的所产生 的系统误差 。
3 试剂
3,1 荧光素标记 的单克隆抗体
采用荧光素直接标记 的单克隆抗体 (单抗),称直标抗体 。选择直标抗体是淋 巴细胞亚群分析 的关
键步骤,要考虑所选抗体对细胞的反应性 。
3。 1.1 单抗
3.1.2 单抗对细胞 的反应性
CD45表达于所有 白细胞;CD3表达于 T淋 巴细胞;CD4表达于 T辅助/诱导淋 巴细胞 (CD4+T细
胞)和 单核细胞;CD8表达于细胞毒 T细胞 (CD8· T)和 NK细胞;CD19表 达于 B淋巴细胞;CD16表 达
于 NK细胞 、单核 巨噬细胞 、粒细胞和树突状细胞等;CD56表达于 NK细胞和细胞毒 T细胞 。
3.1.3 单抗对淋 巴细胞亚群的鉴定
3.1.4 直标抗体 常用荧光染料
异硫氰酸荧 光 素 (FITC)、 藻红 蛋 白 (PE/RD1)、 藻红 蛋 白偶 联 物 (PECY5)、 多 甲藻 叶绿 素 蛋 白
(Pe￡P)、 藻红蛋 白-德州红偶联物 (ECD)和 别藻青蛋 白 (APC)。 除别藻青蛋 白(APC)外,其他荧 光染
料均采用 488nm的激发光源激发,最大发射波长分别为 525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。
别藻青蛋 白(APC)的激发光源为 630nm,最大发射波长为 660nm。
3.2 溶血素
使用与仪器相匹配 的溶血素 (内含 固定液),并严格按照使用说 明和注意事项进行操作 。如果使用
没有固定作用的溶血剂 (如 氯化铵和低渗缓 冲液等),染 色后标本需要保存在 4℃,并 在 1h内完成上机
检测。
4 标本采集和处理
4.1 生物安全
血液和体液标本中可能存在致病性甚至致死性的活体病原微生物,所 有标本都应当作潜在传染源
来处理。
4.1.1 标本采集
避免被针头刺伤,针头丢弃人利器盒中,严禁复帽、弯曲、折断针头或者从注射器上取下针头。
4.1,2 安全着装
所有接触血液标本的人员都应戴手套、穿实验室工作服。当标本处理过程中有飞溅的可能性,应带
好口罩和防护眼罩,避免眼、口、鼻等部位接触标本。在所有工作结束后和离开实验室前,应脱掉手套并
洗手。
4.1.3 生物安全柜 (BsC)
所有的操作都应该在生物安全柜中进行 (I类或 Ⅱ类 BSC);即使条件不允许,对 于可能产生微粒
或气溶胶的操作 (如 涡旋、打开真空管等)仍需要在 BSC中进行。
4.1.4 离心
标本离心时需要放在封闭的容器中,避免气溶胶形成。
4.1.5 吸旦
应用手工或电动移液器,严禁用嘴吸量。
4.1.6 利器
避免使用利器,如针头、玻璃巴斯德移液管、玻璃容器等。
4.1.7 血液溢洒
血液溢洒时,立 即用合适的试剂擦拭干净,如 1:10稀释的新鲜配制的 0.71mol/L次氯酸钠 (未稀
释的家用漂白剂)或适当稀释的医用消毒剂。
4.1.8 废弃物处理和标本灭活
实验室废弃物处置的管理应符合国家、地方的相关要求,所有不再需要的标本和其他生物材料应弃
置于套有生物危险标志的黄色密封且防漏的塑料袋的容器内,用 过的针头等利器应放人利器盒中。
实验室标本需要事先灭活处理,将标本与广谱碘伏和漂白剂混合作用 24h后再进行适当处理。由
于漂白剂与氯化铵作用可产生有毒的氯气,故漂白剂不能用于处理含有氯化铵的溶液。
4.1.9 固定液
0.1%~2,0%多聚甲醛或甲醛缓冲液是常用的固定液,用 于对感染的标本在分析前进行灭活,能够
灭活 HⅣ 等病毒的 3个~5个对数级的病毒载量。在染色过程中的最后一次离心后,用含有多聚甲醛
或甲醛缓冲液(pH7,0~7,4)处理,4℃ 保存待测。建议每周配置新鲜的多聚甲醛或甲醛缓冲液。使用
含有罔定液成分的商品化裂解液时,无需再重复使用多聚甲醛或甲醛缓冲液。
4.1,10 非固定标本
对于非固定标本,实验室应制定合适的生物安全规则以将感染病原体的暴露降到最小。由于暴露
在空气中的流式细胞仪液流系统产生的气溶胶具有潜在的危险,所 以应提高警惕,严格按照制造商的生
物安全建议进行操作。
4.1.ll 设备消毒
流式细胞仪的废液桶中需要装有 占其体积 1/10的 0.71mol/L次氯酸钠 (未 稀释的家用漂白剂)。
实验室设备应该用具有灭活传染源作用的溶液或新配制的 10%家用漂白剂消毒,尤 其在设备维修和保
养前给予严格消毒。
4.2 标本标识
所有检测用标本应及时贴上标签,标签上应注有患耆的姓名、患者唯一的识别码、检测项 目、标本采
集的日期和时间,必要时标注检测实验室。如果使用检查申请单,申 请单应和标本粘贴在一起送检,申
请单上应标明患者的姓名、检测项 目、年龄、性别、标本采集 日期和时间、申请医生的姓名和标本类型
(如:全血),必 要时标注检测实验室。
4.3 抗凝剂和采集容器
首选乙二胺四乙酸盐(EDTA-K2/EDTA-K3)抗 凝真空管进行标本采集,亦可采用肝素钠抗凝或枸
橼酸钠抗凝(ACD)的 真空管进行采集,EDTA盐抗凝标本在室温下稳定保存 12h~24h,超过 30h的
EDTA盐抗凝标本中粒细胞可能会减少,肝素钠或枸橼酸钠抗凝标本可稳定保存至 48h。 如果标本用
血细胞分析仪同时进行白细胞计数和分类,则 应该选择 EDTA盐作为抗凝剂。
4.4 标本质量
4.4.1 标本 目视观察
可观察到的标本问题常见有两种类型:一是变性或损坏的标本,这需要立即弃之。二是在标本处理
过程中出现错误操作,这需要进行进一步评价。错误操作问题需要记录下来,这对标本的处理、分析以
及结果的解释都很有帮助。
4.4.2 溶血
严重溶血的标本应该放弃检测,所有可能破坏标本完整性的异常情况均应密切观察,并 且记录下
来,以 利于后续的处理、分析和结果解释。
4,4.3 凝血
即使是很小的血凝块也会引起血液中某些成分的选择性丢失或改变,凝血的标本尽可能弃用。
4.4.4 温度极限
如果标本是通过长距离的路程送到实验室的,标本就有可能暴露在非允许储存温度的环境中,所以
接到标本后应确认标本是否过热或过冷。即使其他所有的鉴定标准都正常,也 应记录下来以利于后续
的处理、分析和结果解释。
4.4.5 错误标本标签
如果标本没有唯一标识或标本标签与患者信息不符 (患者姓名与标识不符),应 该拒收标本,并及时
与相关医护人员沟通。
4.4.6 标本保存时间及储存条件
可接受的标本最长保存时间取决于抗凝剂的种类、溶血剂 、储存条件及细胞浓度。实验室应该根据
使用的抗凝剂和溶血剂确定可接受的标本最长保存时间。实验室应选择适 当的保存环境以及溶血方
法,使保存标本的检测结果与新鲜标本之间没有明显差别。原则上标本采集后应该立即检测,但是实际
操作中往往无法做到。不能立即检测的标本应该保存于室温 (18℃ ~25℃)环境中。后续的标本处理
和免疫染色应严格按照试剂说明书进行。
4,4,7 标本处理方法
采用全血溶血法,以 便尽可能地回收所有的白细胞。但对于慢性肝病或高脂血症等患者的标本,由
于脂质代谢异常导致红细胞脆性下降,溶血素常常无法完全裂解红细胞,需 要采用密度梯度离心法;但
需要注意的是密度梯度离心法使用密度梯度或冗长的离心步骤,容易导致特殊亚群的不均匀丢失。
标本处理的步骤越多,细胞丢失就越多。而这种丢失在白细胞分类中的比例是不均等的。对于全
血标本,溶血后不能洗涤,这可以使标本处理的步骤减到最少。
4.5 标本运送
4.5.1 内部送检
同一实验室内转移血液标本,盛放血液标本管的容器应标有生物危险标志,并且在血液标本管有破
损的情况下,仍能够容纳标本,可用具有防漏密封层的塑料袋或带有安全盖的塑料容器等。
4.5.2 外部送检
危险物品运送规定和国际航空运输协会 (IATA)危险品规则对含有致病原血液标本的运送均有相
关规定。HIV已 被列为 UN2814类 危险物质,感染级别为 6.2。 包装应符合 UN6.2级别高致病菌性病
原体的安全运输包装标准,标准包装要求含有三层体系:
a) 防水内容器;
b) 防水并含有吸附材料的第二层内容器;
c) 坚固的外包装。
采集标本应在室温 (18℃ ~25℃)环境下尽快送检。
5 细胞绝对计数方法
5,1 单平台方法
5.1.1 白细胞浓度和抗体用且
通过计数板计数或使用血细胞分析仪预先计算标本中的白细胞浓度,并 严格按照操作说明书调整
标本和抗体的最佳比例。淋巴细胞过少的标本应减少单抗用量。淋巴细胞过多的标本应使用含 l%白
蛋白或其他蛋白的磷酸盐缓冲液 (PBS)稀 释到适当浓度。
5.1.2 移液量
标本和荧光微球的移液量应精确,确保准确计数加人的定量微球的浓度和标本体积。
5.1.3 移液次数
使用包被有已知数量的荧光微球的标本处理管,只 需移液一次;而直接在标本中加人已知浓度的荧
光微球悬液,需要移液两次。
5.1.4 离心
为避免荧光微球的丢失,在裂解细胞后不要离心洗涤。
5.2 双平台方法
淋巴细胞亚群绝对计数由全血细胞分析仪测定的白细胞计数计算得到,不 能使用淋巴细胞计数进
行计算。
单平台方法是首选方法,它减轻了室间变异并避免了多台仪器间的系统误差。
6 免疫荧光染色
6.2.2 裂解红细胞
裂解红细胞的方法与使用的溶血素有关,裂解时间和方法按照所用溶血素说明书进行操作。
6.2.3 离心
离心洗涤方法与溶血素有关,按照所用溶血素说明书进行操作。单平台绝对计数法在裂解红细胞
后,不要离心洗涤,并在上机检测前向待测标本中加人定量荧光微球。
6.2.4 染色后标本保存
制备好的标本在上机分析前在 40℃ ~1o℃下避光保存,并在 24h内上机检测,检测前混匀细胞 。
推荐使用商品化组合抗体的体外诊断试剂。如实验室 自已准备组合单抗,要求在每次试验前新鲜
配制。组合抗体中每一种抗体都需要分别滴定以明确其噪音与阳性信号的最佳分离滴度,并 检测作为
组合抗体使用和作为组合抗体 的成分之一单独使用 的平均荧光强度和阳性率,其 可 比性需在均值
±2SD之内。
7 对照标本
7.1 同型对照
淋巴细胞亚群分析不需要同型对照,这是因为 CD3、 CD4和 CD8阳性细胞独立成群,与 阴性细胞群
容易区分。
7.2 针对方法学的阳性对照
7.2.1 目的
监测流式细胞仪上机分析前的环节是否出现问题。由于某种疾病导致方法学阳性对照的结果在参
考范围之外,不会造成同时处理的其他标本的检测结果出现错误。由于裂解红细胞不完全或染色效果
差,包括阳性对照在内的所有标本都会出现结果偏差。
7.2.2 种类
全血标本、商品化荧光微球试剂。
7,2.3 使用频率
每次上机时都需要使用。
7.3 评价试剂的阳性对照
7.3.1 目的
检测新批号试剂和当前批号试剂的染色效率是否出现问题。当怀疑试剂出现问题时,采 用该试剂
与已知可接受性能批号的试剂同时操作进行验证。
7.3.2 种类
全血标本 、冻干淋巴细胞。
7.3.3 使用频率
更换试剂前后。
8 流式细胞仪的质虽控制
8.1 验证和调整光路及规范光路设置
8.1.1 电压和增益
在每次开机时,首先采用荧光微球光路质控品设置和调整仪器光学检测通道的电压和增益,确保其
处于厂家或实验室根据特定的实验状态所设定的可接受范围内,并且保持每次开机时仪器性能稳定,对
荧光抗体或全血标本最适合。
8.1.2 峰值及变异系数
调整散射光峰和荧光峰,使之置于相应通道的同一狭小范围内,要求所有光学检测通道所使用的光
学参数和荧光参数均为均质峰,其变异系数应符合所用流式细胞仪的技术要求。
8.1.3 仪器设置的标准化
连续 5d上机测定荧光微球在每个光学检测通道的平均通道数和变异系数 (CV%),每天共测定
4次,然后计算出这些参数的均数 (Ξ)及标准差 (SD),以 Ξ±2SD为 可接受范围。当出现偏差时,应 查
找和解决问题,再进行光路的重新调整。维持上述的仪器设置条件,用 于后续的仪器敏感性和荧光补偿
设置的监测。
8.2 调整荧光分辨率
8.2.1 光路电压
采用未加直标抗体但经溶血素裂解的新鲜全血标本调整光电倍增管(PMT)电 压。未染色淋巴细
胞的自发荧光应完全在阴性区域,所使用的检测通道内荧光直方图的淋巴细胞阳性率< 2%,双荧光散
点图内的未染色细胞位于散点图的左下象限内。
保持与检测临床标本时相同的 PMT电压设置,用 已知相对荧光强度的荧光微球上机测定,如 仪器
厂商提供的标准品。通过连续 5d、共 ⒛ 次的重复测定得到每一种荧光微球的可接受平均荧光强度范
围。要求每一种荧光微球的平均荧光强度检测值,其 相关系数应≥0,98。 在仪器 PMT电压不变的情
况下,各种荧光微球的荧光线性 、平均荧光强度差异应保持不变。荧光线性 图的绘制遵从制造商的
建议 。
8.2.2 弱表达和自发荧光
评价标准品或校准品或细胞对弱表达荧光与 自发荧光的区分能力。
8.2.3 峰间变异系数
确定峰间最小的可接受数据,监测此差异并校正任何 日常偏差。
流式细胞仪应使每个荧光检测通道都能将弱表达峰和 自发荧光峰区分开,每 月进行一次或按照仪
器制造商的推荐周期执行。
8.3 调整荧光补偿
8.3.1 目的
当采用两种及以上抗体组合方案进行淋巴细胞亚群分析时,或 当光学检测通道的电压及增益发生
变动时,或 当仪器维修保养后,都需要进行荧光补偿调整。
8.3.2 方法
8.3.2.1 荧光补偿试剂
选择与最强荧光信号相匹配的补偿试剂。三色抗体组合分析时,通 过含有荧光微球或细胞补偿颗
粒的 4个单标记标本管调整补偿,包括无直标抗体标本管、仅含 FITC直标抗体阳性标本管、仅含 PE直
标抗体阳性标本管、仅含第三种直标抗体阳性标本管。四色抗体组合分析时,需要在三色抗体组合分析
的基础上,增 加仅含第四种直标抗体阳性标本管。
8.3.2.2 三色组合方案的荧光补偿
三色抗体组合分析时,补偿应按适当的顺序进行,依次为 FITC、 PE和 第三种荧光。将不应该是两
种荧光抗体双阳性的细胞群调整到相应的直角荧光象限中,使双阳象限中无荧光重叠。避免过度补偿,
以防将双阳性细胞错误地识别为单阳性细胞。
8.3.2.3 四色组合方案的荧光补偿
按照操作说明书执行,避免过度补偿 。可以采用手工方式,也可以采用软件 自动补偿方式。
8.4 性能评估
8.4.1 准确度
通过将 自己实验室的检测结果与参考实验室的检测结果进行 比对获得。
8.4.2 特异度
每个实验室需要就流式细胞术检验结果与参考方法 (如 免疫荧光染色法)检 验结果的偏差,建 立实
验室内部可接受的偏差率。推荐可接受偏差率为 5%,每 3个月进行一次特异性检测。
8.4.3 灵敏度
依赖于单抗滴度、仪器最佳性能状态的建立与仪器校准、检测细胞数量和细胞进样速率等。抗体滴
定的测试 、新使用抗体的平行测定都是需要的,并要求做好相应文件记录。
8.4.4 精密度
用于衡量单份标本荧光......
|