[PDF] WS/T 594-2018 - 英文版
| 标准号码 | 美元 | 购买PDF | 工期 | 标准名称(英文版) |
| WS/T 594-2018 | 249 | WS/T 594-2018 | <=3 | 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 |
| 基本信息 | |
|---|---|
| 标准编号 | WS/T 594-2018 (WS/T594-2018) |
| 中文名称 | 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法 |
| 英文名称 | Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica |
| 行业 | 卫生行业标准 (推荐) |
| 中标分类 | C05 |
| 字数估计 | 10,179 |
| 发布日期 | 2018-03-01 |
| 实施日期 | 2018-08-01 |
| 标准依据 | 国卫通(2018)3号 |
| 发布机构 | 卫生健康委员会 |
WS/T 594-2018
Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting insensitive ace allele in the Musca domestica
ICS 11.020
C 05
WS
中华人民共和国卫生行业标准
蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱
酯酶等位基因检测法
Test methods of fly resistance to insecticides-A molecular method for detecting
insensitive ace allele in the Musca domestica
2018 - 03 - 01发布
2018 - 08 - 01实施
中国人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准主要起草单位：中国科学院动物研究所、北京市疾病预防控制中心、扬州大学、中国疾病预
防控制中心传染病预防控制所、中国农业大学、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院微生物流行
病研究所、上海市疾病预防控制中心。
本标准主要起草人：邱星辉、李梅、曾晓芃、钱坤、周小洁、李静、刘起勇、高希武、赵彤言、冷
培恩。
蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因检测法
1 范围
本标准规定了家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶等位基因的检测方法。
本标准适用于家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸位点基因型的检测。
2 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1
乙酰胆碱酯酶 acetyl cholinesterase
存在于生物体的一种水解酶，由乙酰胆碱酯酶基因ace编码。
2.2
等位基因 allele
存在于同一物种的相同基因的不同形式互称为等位基因。
2.3
342G、342V 和 342A
342G、342V和342A分别表示家蝇乙酰胆碱酯酶第342氨基酸残基位点上的氨基酸为甘氨酸（Gly）、
缬氨酸（Val）和丙氨酸（Ala）。
3 样本采集
采用诱捕或网捕等方法从现场采集家蝇成虫内，浸泡在100%乙醇溶液中带回实验室。浸泡样品可在
4 ℃条件下短期（6个月内）保存，可在-20 ℃以下长期保存。
4 引物
录A。配制为10 μmol/L浓度，保存于-20 ℃冰柜。
5 仪器设备
5.1 PCR（聚合酶链式反应）仪。
5.2 琼脂糖凝胶电泳仪。
5.3 凝胶成像仪。
5.4 恒温水浴锅。
6 主要试剂
6.1 DNA聚合酶（Taq酶）。
6.2 限制性内切酶Bsp1286I。
6.3 限制性内切酶Eae I。
7 操作步骤
7.1 在 PCR管中加入 10×PCR 缓冲液 (含 100 mmol/L Tris-HCl, 500 mmol/L KCl, 15 mmol/L MgCl2)
2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，引物 F 0.5 μL，引物 R 0.5 μL，单头家蝇的基因组 DNA 1 μL
（100 ng～300 ng，提取方法可参见附录 B，也可用商售的 DNA提取试剂盒或其他类似方法提取）和 Taq
酶 (2～5个单位)，用灭菌水补齐至 25 μL，混匀。
7.2 将 PCR管放入 PCR 仪中，设置 PCR反应程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃
30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。运行程序。
7.3 PCR运行结束后，取 5 μL PCR产物在 1.5% 的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压设定在 160 V，电泳
20 min后在紫外光下检测，有清楚单一的 609bp 的条带的 PCR产物用于进行以下酶切反应。
7.4 取合格样品（即电泳检测产物为 609bp）的 PCR产物设置两个酶切反应，反应 A 用 Bsp1286I酶、
反应 B用 Eae I酶进行酶切，酶切反应体系的设置根据酶产品的使用说明进行（参见附录 C）。
7.5 将酶切后的产物上样在 1.5% 的琼脂糖凝胶上，电压设定在 160 V，电泳 20 min后在紫外光下检
测。
8 基因型确定
根据酶切产物的电泳结果（参见附录 D），确定家蝇个体的乙酰胆碱酯酶的基因型，见表 1。
表1 家蝇个体乙酰胆碱酯酶的基因型确定
反应 I (加 Bsp1286I 酶切) 反应 II (加 Eae I 酶切) 乙酰胆碱酯酶 342 氨基酸位点基因型
361bp 、248bp 609bp 敏感型纯合子 （G/G）
609bp 609bp 不敏感 I 型纯合子（V/V）
609bp 361bp、248bp 不敏感 II 型纯合子（A/A）
609bp、361bp、248bp 609bp 不敏感 I 型/敏感型杂合子（G/V）
609bp、361bp、248bp 609bp、361bp、248bp 不敏感 II 型/敏感型杂合子 （G/A ）
609bp 609bp、361bp、248bp 不敏感 I 型/不敏感 II 型杂合子（V/A ）
注：G 表示氨基酸残基为 Gly（甘氨酸）；V 表示氨基酸残基为 Val（缬氨酸）；A 表示氨基酸残基为 Aal（丙
氨酸）。
A A
附 录 A
（资料性附录）
引物设计参照序列
342V GCGGTTACG
342A GCGGTTACG
342G GCGGTTACG
注：下划线分别对应上游引物与下游引物序列(反向互补)； 方框内为编码342位氨基酸的密码子。
B B
附 录 B
（资料性附录）
家蝇基因组 DNA 提取方法
B.1 取单头家蝇，去除腹部后置于 1.5mL体积的离心管 (eppendorf 管) 中，加入 0.5 mL 新鲜配制的
裂解液（含 100 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl, 1% SDS，
0.15 mmol/L 精胺，0.5 mmol/L 亚精胺 和 2 U/mL的蛋白酶K），碾磨将虫体捣碎，置 60 ℃温浴，
20 min后取出。
B.2 加入 75 μL的 8 M醋酸钾，混匀，置冰上 10 min。
B.3 14000 g 离心 5 min，取 400 μL上清液转至新的离心管。
B.4 加入 800 μL 冰冷的 100%乙醇，室温放置 10 min
B.5 离心 10 min，弃上清，离心沉淀用 500 μL的 70%乙醇清洗。
B.6 离心 5 min，沉淀干燥后（可置超净台中，开通风），加入 50 μL灭菌水或TE缓冲液
（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH=8.0）中溶解。提取的DNA样品可直接用于PCR。样品
保存 4 ℃备用，也可于-20 ℃中长期保存。
C C
附 录 C
（资料性附录）
酶切体系设置范例
C.1 酶切反应体系的设置见表C.1。
表C.1 酶切反应体系
成分 10×NEBuffer 4 100×BSA Bsp1286I Eae I PCR产物 灭菌水
反应 A 2 μL 0.5 μL 0.5 μL 0 1 μg 补至20 μL
反应B 2 μL 0 0 0.5 μL 1 μg 补至20 μL
注：采用限制性内切酶Bsp1286I， EaeI。10×NEBuffer 4和100×BSA随酶提供，其中 1×NEBuffer
4 含 50 mmol/L KAc，20 mmol/L Tris-Ac，10 mmol/L Mg(Ac)2，1 mmol/L DDT，pH7.9 (25 ℃
测定)，100× BSA 成分为10 mg/mL的BSA (牛血清白蛋白)。
C.2 37℃下进行温浴，时间 2h～4h，反应结束，直接用于电泳检测。
D D
附 录 D
（资料性附录）
家蝇乙酰胆碱酯酶 342位点不同基因型 PCR产物的酶切结果
家蝇乙酰胆碱酯酶342位点不同基因型的PCR产物酶切结果见图D.1。
G--氨基酸残基为Gly（甘氨酸）；
V--氨基酸残基为Val（缬氨酸）；
A--氨基酸残基为Aal（丙氨酸）；
G/G--敏感型纯合子；
V/V--不敏感 I型纯合子；
A/A--不敏感II......