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[PDF] GB 4789.10-2010 - 英文版

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GB 4789.10-2010 英文版 639 GB 4789.10-2010 [PDF]天数 <=3 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 作废

基本信息
标准编号 GB 4789.10-2010 (GB4789.10-2010)
中文名称 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
英文名称 National food safety standard. Food microbiological examination. Staphylococcus aureus
行业 国家标准
中标分类 C53
国际标准分类 07.100.30
字数估计 16,139
发布日期 2010-03-26
实施日期 2010-06-01
旧标准 (被替代) GB/T 4789.10-2008; GB/T 4789.37-2008
标准依据 卫通(2010)7号;国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号
发布机构 中华人民共和国卫生部
范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的检验方法。本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。

GB 4789.10-2010 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 National food safety standard Food microbiological examination: Staphylococcus aureus 中华人民共和国卫生部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施 前言 本标准代替 GB/T 4789.10-2008《食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》和 GB/T 4789.37-2008《食品卫生微生物学检验 金黄色葡萄球菌计数》。 本标准与 GB/T 4789.10-2008 和 GB/T 4789.37-2008 相比,主要修改如下: --修改了标准的中英文名称; --修改了范围; --规范了样品制备过程; --增加了计算公式中系数 1.1 的解释; --修改了附录 A 中胰酪胨大豆肉汤的名称,规范为 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤; --增加了第二法金黄色葡萄球菌 Baird-Parker 平板计数和第三法金黄色葡萄球菌 MPN 计数。 本标准的附录 A、附录 B、附录 C 是规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为: --GB 4789.10-84、GB 4789.10-1994、GB/T 4789.10-2003、GB/T 4789.10-2008。 --GB/T 4789.37-2008。 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 1 范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的检验方法。 本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的 食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色 葡萄球菌的计数。 2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下: 2.1 恒温培养箱:36 ℃±1 ℃。 2.2 冰箱:2 ℃~5 ℃。 2.3 恒温水浴箱:37 ℃~65 ℃。 2.4 天平:感量 0.1 g。 2.5 均质器。 2.6 振荡器。 2.7 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头。 2.8 无菌锥形瓶:容量 100 mL、500 mL。 2.9 无菌培养皿:直径 90 mm。 2.10 注射器:0.5 mL。 2.11 pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 3 培养基和试剂 3.1 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤:见附录 A 中 A.1。 3.2 7.5 %氯化钠肉汤:见附录 A 中 A.2。 3.3 血琼脂平板:见附录 A 中 A.3。 3.4 Baird-Parker 琼脂平板:见附录 A 中 A.4。 3.5 脑心浸出液肉汤(BHI) :见附录 A 中 A.5。 3.6 兔血浆:见附录 A 中 A.6。 3.7 稀释液:磷酸盐缓冲液:见附录 A 中 A.7。 3.8 营养琼脂小斜面:见附录 A 中 A.8。 3.9 革兰氏染色液:见附录 A 中 A.9。 3.10 无菌生理盐水:见附录 A 中 A.10。 36 ±1 ℃ ℃ 18 h~24 h 36 ±1 ℃ ℃ 18 h~24 h 第一法 金黄色葡萄球菌定性检验 4 检验程序 金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。 图1 金黄色葡萄球菌检验程序 5 操作步骤 5.1 样品的处理 称取 25 g 样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内, 8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨 大豆肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min。若样品为液态,吸取 25 mL 样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃 珠)中,振荡混匀。 5.2 增菌和分离培养 36 ±1℃ ℃ 血平板 18 h~24 h Baird-Parker 平板 18 h~24 h 或 45 h~48 h Baird-Parker 平板,血平板 检样 25 g(mL)样品+225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤,均质 血浆凝固酶试验 BHI 肉汤和营养琼脂小斜面 观察溶血涂片染色 报 告 5.2.1 将上述样品匀液于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生 长,污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 5.2.2 将上述培养物,分别划线接种到 Baird-Parker 平板和血平板,血平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。 Baird-Parker 平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h 或 45 h~48 h。 5.2.3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上,菌落直径为 2 mm~3 mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为 淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度,偶然会遇 到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌 落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、 金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固 酶试验。 5.3 鉴定 5.3.1 染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为 0.5 μm~1 μm。 5.3.2 血浆凝固酶试验:挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上,分别接种到 5 mL BHI 和营养琼脂小斜面,36 ±1 ℃ ℃培养 18 h~24 h。 取新鲜配置兔血浆 0.5 mL,放入小试管中,再加入 BHI 培养物 0.2 mL~0.3 mL,振荡摇匀,置 36 ±1 ℃ ℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察 6 h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝 块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌 株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI,36 ±1 ℃ ℃培养 18 h~48 h,重复试验。 5.4 葡萄球菌肠毒素的检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录B检测葡萄球菌 肠毒素。 6 结果与报告 6.1 结果判定:符合 5.2.3、5.3,可判定为金黄色葡萄球菌。 6.2 结果报告:在 25 g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。 36 ℃±1 ℃ 第二法 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数 7 检验程序 金黄色葡萄球菌平板计数程序见图2。 图 2 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker 平板法检验程序 8 操作步骤 8.1 样品的稀释 8.1.1 固体和半固体样品:称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min~10000 r/min均质1 min~2 min,或置盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1 min~2 min,制成1:10的样品匀液。 8.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶 内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。 8.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无 菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打使 其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。 8.1.4 按 8.1.3 操作程序,制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用 1 次 1 mL 无菌吸管或 吸头。 8.2 样品的接种 根据对样品污染状况的估计,选择 2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在 进行 10 倍递增稀释时,每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别加 10 倍系列稀释 选择 2 个~3 个连续的适宜稀释度的样品匀液,接种 Baird-Parker 平板 计数及血浆凝固酶试验 报 告 检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液,均质 45 h~48 h 入三块Baird-Parker平板,然后用无菌L棒涂布整个平板,注意不要触及平板边缘。使用前,如Baird-Parker 平板表面有水珠,可放在 25 ℃~50 ℃的培养箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。 8.3 培养 8.3.1.1 在通常情况下,涂布后,将平板静置 10 min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱 36 ±1 ℃ ℃培养 1 h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36 ℃±1 ℃培养,45 h~48 h。 8.4 典型菌落计数和确认 8.4.1 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上,菌落直径为 2 mm~3 mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为 淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度,偶然会遇 到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌 落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。 8.4.2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20 CFU~ 200 CFU 之间的平板,计数典型菌落数。如果: a)只有一个稀释度平板的菌落数在20 CFU~200 CFU之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的 典型菌落; b) 最低稀释度平板的菌落数小于 20 CFU 且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落; c) 某一稀释度平板的菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落, 应计数该稀释度平板上的典型菌落; d) 某一稀释度平板的菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落,且下一稀释度平板上有典型菌落,但 其平板上的菌落数不在 20 CFU~200 CFU 之间,应计数该稀释度平板上的典型菌落; 以上按公式(1)计算。 e) 2 个连续稀释度的平板菌落数均在 20 CFU~200 CFU 之间,按公式(2)计算。 8.4.3 从典型菌落中任选 5 个菌落(小于 5 个全选),分别按 5.3.2 做血浆凝固酶试验。 9 结果计算: 公式(1): Cd ABT = (1) 式中: T--样品中金黄色葡萄球菌菌落数; A--某一稀释度典型菌落的总数; B--某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数; C--某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数; d--稀释因子。 公式(2): (2) 式中: T --样品中金黄色葡萄球菌菌落数; A1--第一稀释度(低稀释倍数)典型菌落的总数; A2--第二稀释度(高稀释倍数)典型菌落的总数; B1--第一稀释度(低稀释倍数)血浆凝固酶阳性的菌落数; CBACBAT 1.1 222111 += B2--第二稀释度(高稀释倍数)血浆凝固酶阳性的菌落数; C1--第一稀释度(低稀释倍数)用于血浆凝固酶试验的菌落数; C2--第二稀释度(高稀释倍数)用于血浆凝固酶试验的菌落数; 1.1--计算系数; d --稀释因子(第一稀释度)。 10 结果与报告 根据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数,按9中公式计算,报告每g(mL)样品中金 黄色葡萄球菌数,以CFU/g(mL)表示;如T值为0,则以小于1乘以最低稀释倍数报告。 第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数 11 检验程序 金黄色葡萄球菌MPN计数程序见图3。 图3 金黄色葡萄球菌MPN法检验程序 12 操作步骤 12.1 样品的稀释 按8.1进行。 12.2 接种和培养 12.2.1 根据对样品污染状况的估计,选择 3 个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进 行 10 倍递增稀释时,每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液接种到 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管,每个稀 释度接种 3 管,将上述接种物于 36 ±1 ℃ ℃培养 45 h~48 h。 10 倍系列稀释 选择 3 个适宜稀释度的样品匀液,各吸取 1 mL, 分别接种于 3 管 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤。 接种 Baird-Parker 平板 血浆凝固酶试验 检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液,均质 查 MPN 表 报告结果 45 h~48 h 36 ℃±1 ℃ 36 ℃±1 ℃ 45 h~48 h 12.2.2 用接种环从有细菌生长的各管中,移取 1 环,分别接种 Baird-Parker 平板,36 ±1 ℃ ℃培养 45 h~ 48 h。 12.3 典型菌落确认 12.3.1 见 8.4.1。 12.3.2 从典型菌落中至少挑取 1 个菌落接种到 BHI 肉汤和营养琼脂斜面,36 ±1 ℃ ℃培养 18 h~24 h。 进行血浆凝固酶试验,见 5.3.2。 13 结果与报告 计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数,查 MPN 检索表(见附录 C),报告每 g(mL)样品中金 黄色葡萄球菌的最可能数,以 MPN/g(mL)表示。 附录 A (规范性附录) 培养基和试剂 A.1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤 A.1.1 成分 胰酪胨(或胰蛋白胨) 17.0 g 植物蛋白胨(或大豆蛋白胨) 3.0 g 氯化钠 100.0 g 磷酸氢二钾 2.5 g 丙酮酸钠 10.0 g 葡萄糖 2.5 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.3±0.2 A.1.2 制法 将上述成分混合,加热,轻轻搅拌并溶解,调节 pH,分装,每瓶 225 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。 A.2 7.5%氯化钠肉汤 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化钠 75 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.4 A.2.2 制法 将上述成分加热溶解,调节 pH,分装,每瓶 225 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。 A.3 血琼脂平板 A.3.1 成分 豆粉琼脂(pH7.4~7.6) 100 mL 脱纤维羊血(或兔血) 5 mL~10 mL A.3.2 制法 加热溶化琼脂,冷却至 50 ℃,以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板。 A.4 Baird-Parker琼脂平板 A.4.1 成分 胰蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 酵母膏 1.0 g 丙酮酸钠 10.0 g 甘氨酸 12.0 g 氯化锂(LiCl·6H2O) 5.0 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 950 mL pH 7.0±0.2 A.4.2 增菌剂的配法 30%卵黄盐水 50 mL 与经过除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10 mL 混合,保存于冰箱内。 A.4.3 制法 将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节 pH。分装每瓶 95 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。 临用时加热溶化琼脂,冷至 50 ℃,每 95 mL 加入预热至 50 ℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5 mL 摇匀后倾注 平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过 48 h。 A.5 脑心浸出液肉汤(BHI) A.5.1 成分 胰蛋白质胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 2.5 g 葡萄糖 2.0 g 牛心浸出液 500 mL pH 7.4±0.2 A.5.2 制法 加热溶解,调节 pH,分装 16 mm×160 mm 试管,每管 5 mL 置 121 ℃,15 min 灭菌。 A.6 兔血浆 取柠檬酸钠 3.8 g,加蒸馏水 100 mL,溶解后过滤,装瓶,121 ℃高压灭菌 15 min。 兔血浆制备:取 3.8%柠檬酸钠溶液一份,加兔全血四份,混好静置 (或以 3000 r/min 离心 30 min), 使血液细胞下降,即可得血浆。 A.7 磷酸盐缓冲液 A.7.1 成分: 磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0 g 蒸馏水 500 mL pH 7.2 A.7.2 制法: 贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节 pH至7.2,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。 稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃高压灭菌15 min。 A.8 营养琼脂小斜面 A.8.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 3.0 g 氯化钠 5.0 g 琼脂 15.0 g~20.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 7.2~7.4 A.8.2 制法 将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2 mL调节pH至7.2~7.4。加入琼 脂,加热煮沸,使琼脂溶化,分装13 mm×130 mm管,121 ℃高压灭菌15 min。 A.9 革兰氏染色液 A.9.1 结晶紫染色液 A.9.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95%乙醇 20.0 mL 1%草酸铵水溶液 80.0 mL A.9.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。 A.9.2 革兰氏碘液 A.9.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.9.2.2 制法 将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300 mL。 A.9.3 沙黄复染液 A.9.3.1 成分 沙黄 0.25 g 95%乙醇 10.0 mL 蒸馏水 90.0 mL A.9.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。 A.9.4 染色法 a) 涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染 1 min,水洗。 b) 滴加革兰氏碘液,作用 1 min,水洗。 c) 滴加 95%乙醇脱色约 15 s~30 s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。 d) 滴加复染液,复染 1 min,水洗、待干、镜检。 A.10 无菌生理盐水 A.10.1 成分 氯化钠 8.5 g 蒸馏水 1 000 mL A.10.2 制法 称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。 附录 B (规范性附录) 葡萄球菌肠毒素检验 B.1 试剂和材料 除另有规定外,所用试剂均为分析纯,试验用水应符合GB/T 6682对一级水的规定。 B.1.1 A、B、C、D、E 型金黄色葡萄球菌肠毒素分型 ELISA 检测试剂盒。 B.1.2 pH 试纸,范围在 3.5~8.0,精度 0.1。 B.1.3 0.25 mol/L、pH8.0 的 Tris 缓冲液:将 121.1g 的 ......