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GB 4789.10-2010

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GB 4789.10-2010 英文版 639 GB 4789.10-2010 有增值税发票,[PDF]天数 <=3 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验 GB 4789.10-2010 作废

基本信息
标准编号 GB 4789.10-2010 (GB4789.10-2010)
中文名称 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
英文名称 National food safety standard. Food microbiological examination. Staphylococcus aureus
行业 国家标准
中标分类 C53
国际标准分类 07.100.30
字数估计 16,139
发布日期 2010-03-26
实施日期 2010-06-01
旧标准 (被替代) GB/T 4789.10-2008; GB/T 4789.37-2008
标准依据 卫通(2010)7号;国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号
发布机构 中华人民共和国卫生部
范围 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的检验方法。本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。

GB 4789.10-2010: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
GB 4789.10-2010 英文名称: National food safety standard -- Food microbiological examination -- Staphylococcus aureus
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验
1 范围
本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的检验方法。
本标准第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验;第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的
食品中金黄色葡萄球菌的计数;第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
5 操作步骤
5.1 样品的处理
称取 25 g 样品至盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内,
8000 r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨
大豆肉汤的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min。若样品为液态,吸取 25 mL 样品至盛有
225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀。
5.2 增菌和分离培养
5.2.1 将上述样品匀液于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生
长,污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。
5.2.2 将上述培养物,分别划线接种到 Baird-Parker 平板和血平板,血平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。
Baird-Parker 平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h 或 45 h~48 h。
5.2.3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上,菌落直径为 2 mm~3 mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为
淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度,偶然会遇
到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌
落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。在血平板上,形成菌落较大,圆形、光滑凸起、湿润、
金黄色(有时为白色),菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
5.3 鉴定
5.3.1 染色镜检:金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌,排列呈葡萄球状,无芽胞,无荚膜,直径约为0.5 μm~1 μm。
5.3.2 血浆凝固酶试验:挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上,分别接种到 5 mL BHI
和营养琼脂小斜面,36 ±1 ℃ ℃培养 18 h~24 h。
取新鲜配置兔血浆 0.5 mL,放入小试管中,再加入 BHI 培养物 0.2 mL~0.3 mL,振荡摇匀,置 36
±1 ℃ ℃温箱或水浴箱内,每半小时观察一次,观察 6 h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时,呈现凝
块)或凝固体积大于原体积的一半,被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌
株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂,按说明书操作,进行血浆凝固酶试验。
结果如可疑,挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI,36 ±1 ℃ ℃培养 18 h~48 h,重复试验。
5.4 葡萄球菌肠毒素的检验
可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定,应按附录B检测葡萄球菌肠毒素。
6 结果与报告
6.1 结果判定:符合 5.2.3、5.3,可判定为金黄色葡萄球菌。
6.2 结果报告:在 25 g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
7 检验程序
金黄色葡萄球菌平板计数程序见图2。
8 操作步骤
8.1 样品的稀释
8.1.1 固体和半固体样品:称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000
r/min~10000 r/min均质1 min~2 min,或置盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1
min~2 min,制成1:10的样品匀液。
8.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶
内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:10的样品匀液。
8.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL,沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无
菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打使
其混合均匀,制成 1:100 的样品匀液。
8.1.4 按 8.1.3 操作程序,制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次,换用 1 次 1 mL 无菌吸管或吸头。
8.2 样品的接种
根据对样品污染状况的估计,选择 2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在
进行 10 倍递增稀释时,每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别加10 倍系列稀释
选择 2 个~3 个连续的适宜稀释度的样品匀液
8.3 培养
8.3.1.1 在通常情况下,涂布后,将平板静置 10 min,如样液不易吸收,可将平板放在培养箱 36 ±1 ℃
℃培养 1 h;等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,36 ℃±1 ℃培养,45 h~48 h。
8.4 典型菌落计数和确认
8.4.1 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上,菌落直径为 2 mm~3 mm,颜色呈灰色到黑色,边缘为
淡色,周围为一混浊带,在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度,偶然会遇
到非脂肪溶解的类似菌落;但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌
落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。
8.4.2 选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20 CFU~
200 CFU 之间的平板,计数典型菌落数。如果:
a)只有一个稀释度平板的菌落数在20 CFU~200 CFU之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;
b) 最低稀释度平板的菌落数小于 20 CFU 且有典型菌落,计数该稀释度平板上的典型菌落;
c) 某一稀释度平板的菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,
应计数该稀释度平板上的典型菌落;
d) 某一稀释度平板的菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落,且下一稀释度平板上有典型菌落,但
其平板上的菌落数不在 20 CFU~200 CFU 之间,应计数该稀释度平板上的典型菌落;
以上按公式(1)计算。
11 检验程序
金黄色葡萄球菌MPN计数程序见图3。
12 操作步骤
12.1 样品的稀释
按8.1进行。
12.2 接种和培养
12.2.1 根据对样品污染状况的估计,选择 3 个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),在进
行 10 倍递增稀释时,每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液接种到 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤管,每个稀
释度接种 3 管,将上述接种物于 36 ±1 ℃ ℃培养 45 h~48 h。
12.3 典型菌落确认
12.3.1 见 8.4.1。
12.3.2 从典型菌落中至少挑取 1 个菌落接种到 BHI 肉汤和营养琼脂斜面,36 ±1 ℃ ℃培养 18 h~24 h。
进行血浆凝固酶试验,见 5.3.2。
13 结果与报告
计算血浆凝固酶试验阳性菌落对应的管数,查 MPN 检索表(见附录 C),报告每 g(mL)样品中金
黄色葡萄球菌的最可能数,以 MPN/g(mL)表示。
附录 A
(规范性附录)
培养基和试剂
A.1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤
A.1.1 成分
A.3.2 制法
加热溶化琼脂,冷却至 50 ℃,以无菌操作加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板。
A.4.2 增菌剂的配法
30%卵黄盐水 50 mL 与经过除菌过滤的 1%亚碲酸钾溶液 10 mL 混合,保存于冰箱内。
A.4.3 制法
将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节 pH。分装每瓶 95 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。
临用时加热溶化琼脂,冷至 50 ℃,每 95 mL 加入预热至 50 ℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂 5 mL 摇匀后倾注
平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过 48 h。
A.5 脑心浸出液肉汤(BHI)
A.5.2 制法
加热溶解,调节 pH,分装 16 mm×160 mm 试管,每管 5 mL 置 121 ℃,15 min 灭菌。
A.6 兔血浆
取柠檬酸钠 3.8 g,加蒸馏水 100 mL,溶解后过滤,装瓶,121 ℃高压灭菌 15 min。
兔血浆制备:取 3.8%柠檬酸钠溶液一份,加兔全血四份,混好静置 (或以 3000 r/min 离心 30 min),
使血液细胞下降,即可得血浆。
A.7 磷酸盐缓冲液
A.7.2 制法:
贮存液:称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中,用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节
pH至7.2,用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。
稀释液:取贮存液1.25 mL,用蒸馏水稀释至1 000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃高压灭菌15 min。
A.8 营养琼脂小斜面
A.8.2 制法
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2 mL调节pH至7.2~7.4。加入琼
脂,加热煮沸,使琼脂溶化,分装13 mm×130 mm管,121 ℃高压灭菌15 min。
A.9 革兰氏染色液
A.9.1 结晶紫染色液
A.9.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A.9.2 革兰氏碘液
A.9.2.2 制法
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至 300 mL。
A.9.3 沙黄复染液
A.9.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A.10 无菌生理盐水
A.10.2 制法
称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中,121 ℃高压灭菌15 min。
附录 B
(规范性附录)
葡萄球菌肠毒素检验
B.3 原理
本方法可用 A、B、C、D、E 型金黄色葡萄球菌肠毒素分型酶联免疫吸附试剂盒完成。本方法测定
的基础是酶联免疫吸附反应(ELISA)。96 孔酶标板的每一个微孔条的 A~E 孔分别包被了 A、B、C、D、
E 型葡萄球菌肠毒素抗体,H 孔为阳性质控,已包被混合型葡萄球菌肠毒素抗体,F 和 G 孔为阴性质控,
包被了非免疫动物的抗体。样品中如果有葡萄球菌肠毒素,游离的葡萄球菌肠毒素则与各微孔中包被的
特定抗体结合,形成抗原抗体复合物,其余未结合的成分在洗板过程中被洗掉;抗原抗体复合物再与过
氧化物酶标记物(二抗)结合,未结合上的酶标记物在洗板过程中被洗掉;加入酶底物和显色剂并孵育,
酶标记物上的酶催化底物分解,使无色的显色剂变为蓝色;加入反应终止液可使颜色由蓝变黄,并终止
了酶反应;以 450 nm 波长的酶标仪测量微孔溶液的吸光度值,样品中的葡萄球菌肠毒素与吸光度值成正比。
B.4 检测步骤
B.4.1 从分离菌株培养物中检测葡萄球菌肠毒素方法
待测菌株接种营养琼脂斜面(试管18 mm×180 mm)37 ℃培养24 h,用5 mL生理盐水洗下菌落,
倾入60 mL产毒培养基中,每个菌种种一瓶,37 ℃振荡培养48 h,振速为100 次/min,吸出菌液离心,
8000 r/min 20 min,加热100 ℃,10 min,取上清液,取100 μL稀释后的样液进行试验。
B.4.2 从食品中提取和检测葡萄球菌毒素方法
B.4.2.1 乳和乳粉
将 25 g 乳粉溶解到 125 mL、0.25 mol/L、pH8.0 的 Tris 缓冲液中,混匀后同液体乳一样按以下步骤
制备。将乳于 15 ℃,3500 g 离心 10 min。将表面形成的一层脂肪层移走,变成脱脂乳。用蒸馏水对其
进行稀释(1:20)。取 100μL 稀释后的样液进行试验。
B.4.2.2 脂肪含量不超过 40%的食品
称取 10 g 样品绞碎,加入 pH7.4 的 PBS 液 15 mL 进行均质。振摇 15 min。于 15℃,3500g 离心 10
min。必要时,移去上面脂肪层。取上清液进行过滤除菌。取 100 μL 的滤出液进行试验。
B.4.2.3 脂肪含量超过 40%的食品
称取 10 g 样品绞碎,加入 pH7.4 的 PBS 液 15 mL 进行均质。振摇 15 min。于 15 ℃,3500 g 离心
10 min。吸取 5 mL 上层悬浮液,转移到另外一个离心管中,再加入 5 mL 的庚烷,充分混匀 5 min。于
15 ℃,3500 g 离心 5 min。将上部有机相(庚烷层)全部弃去,注意该过程中不要残留庚烷。将下部水
相层进行过滤除菌。取 100 μL 的滤出液进行试验。
B.4.2.4 其它食品可酌情参考上述食品处理方法。
B.4.3 检测
B.4.3.1 所有操作均应在室温(20 ℃~25 ℃)下进行,A、B、C、D、E 型金黄色葡萄球菌肠毒素分
型 ELISA 检测试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温方可使用。测定中吸取不同的试剂和样品溶液
时应更换吸头,用过的吸头以及废液要浸泡到 10 %次氯酸钠溶液中过夜。
B.4.3.2 将所需数量的微孔条插入框架中(一个样品需要一个微孔条)。将样品液加入微孔条的 A~G
孔,每孔 100 μL。H 孔加 100 μL 的阳性对照,用手轻拍微孔板充分混匀,用粘胶纸封住微孔以防溶液
挥发,置室温下孵育 1 h。
B.4.3.3 将孔中液体倾倒至含 10 %次氯酸钠溶液的容器中,并在吸水纸上拍打几次以确保孔内不残留
液体。每孔用多通道加样器注入 250 μL 的洗液,再倾倒掉并在吸水纸上拍干。重复以上洗板操作 4 次。
本步骤也可由自动洗板机完成。
B.4.3.4 每孔加入 100μL 的酶标抗体,用手轻拍微孔板充分混匀,置室温下孵育 1 h。
B.4.3.5 重复 B.4.3.3 的洗板程序。
B.4.3.6 加 50μL 的 TMB 底物和 50μL 的发色剂至每个微孔中,轻拍混匀,室温黑暗避光处孵育 30 min。 ......
   
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