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| 标准编号 | GB 4789.3-2016 (GB4789.3-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数 | | 英文名称 | National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 11,171 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB 4789.3-2010; GB/T 4789.32-2002部分; SN/T 0169-2010部分 | | 标准依据 | 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号 | GB 4789.3-2016
National food safety standard Food microbiological examination: Enumeration of coliforms
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替 GB 4789.3-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》、
GB/T 4789.32-2002《食品卫生微生物学检验 大肠菌群的快速检测》和SN/T 0169-2010《进出口
食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法》大肠菌群计数部分。
本标准与GB 4789.3-2010相比,主要变化如下:
---增加了检验原理;
---修改了适用范围;
---修改了典型菌落的形态描述;
---修改了第二法平板菌落数的选择;
---修改了第二法证实试验;
---修改了第二法平板计数的报告。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 大肠菌群计数
1 范围
本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。
本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较
高的食品中大肠菌群的计数。
2 术语和定义
2.1
大肠菌群 Coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2
最可能数 Mostprobablenumber;MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 检验原理
3.1 MPN法
MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未
生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
3.2 平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带
有沉淀环的菌落。
4 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
4.1 恒温培养箱:36℃ ±1℃。
4.2 冰箱:2℃~5℃。
4.3 恒温水浴箱:46℃±1℃。
4.4 天平:感量0.1g。
4.5 均质器。
4.6 振荡器。
4.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶:容量500mL。
4.9 无菌培养皿:直径90mm。
4.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
4.11 菌落计数器。
5 培养基和试剂
5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA):见A.3。
5.4 无菌磷酸盐缓冲液:见A.4。
5.5 无菌生理盐水:见A.5。
5.6 1mol/LNaOH溶液:见A.6。
5.7 1mol/LHCl溶液:见A.7。
第一法 大肠菌群 MPN计数法
6 检验程序
大肠菌群 MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群 MPN计数法检验程序
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯
内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无
菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。
7.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶
(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制
成1∶10的样品匀液。
7.1.3 样品匀液的pH应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。
7.1.4 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲
液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无
菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
7.1.5 根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释
1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
7.2 初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管
月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤,每管接种1mL(如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤),36℃±
1℃ 培养24h±2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未
产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
7.3 复发酵试验(证实试验)
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(BGLB)管中,
36℃±1℃培养48h±2h,观察产气情况。产气者,计为大肠菌群阳性管。
7.4 大肠菌群最可能数(MPN)的报告
按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索 MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中大肠菌群
的 MPN值。
第二法 大肠菌群平板计数法
8 检验程序
大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。
图2 大肠菌群平板计数法检验程序
9 操作步骤
9.1 样品的稀释
按7.1进行。
9.2 平板计数
9.2.1 选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。同时取1mL
生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
9.2.2 及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平
皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA覆盖平板表
层。翻转平板,置于36℃±1℃培养18h~24h。
9.3 平板菌落数的选择
选取菌落数在15CFU~150CFU之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落
(如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm
或更大,最低稀释度平板低于15CFU的记录具体菌落数。
9.4 证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌
落。分别移种于BGLB肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气,
即可报告为大肠菌群阳性。
9.5 大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每
g(mL)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1mL,在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落,挑
取其中10个接种BGLB肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:100×6/10×104/g(mL)=
6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀
释倍数计算。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤
A.1.1 成分
胰蛋白胨或胰酪胨 20.0g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g
月桂基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
将上述成分溶解于蒸馏水中,调节pH至6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中,每管10mL。
121℃高压灭菌15min。
A.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤
A.2.1 成分
蛋白胨 10.0g
乳糖 10.0g
牛胆粉(oxgal或oxbile)溶液 200mL
0.1%煌绿水溶液 13.3mL
蒸馏水 800mL
A.2.2 制法
将蛋白胨、乳糖溶于约500mL蒸馏水中,加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于
200mL蒸馏水中,调节pH至7.0~7.5),用蒸馏水稀释到975mL,调节pH至7.2±0.1,再加入0.1%
煌绿水溶液13.3mL,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到有玻璃小倒管的试管中,每管
10mL。121℃高压灭菌15min。
A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
A.3.1 成分
蛋白胨 7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖 10.0g
氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性红 0.03g
结晶紫 0.002g
琼脂 15g~18g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调节pH至7.4±0.1。煮沸2min,将培养基融
化并恒温至45℃~50℃倾注平板。使用前临时制备,不得超过3h。
A.4 磷酸盐缓冲液
A.4.1 成分
磷酸二氢钾(KH2PO4) 34.0g
蒸馏水 500mL
A.4.2 制法
贮存液:称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶
液调节pH至7.2±0.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏
水稀释至1000mL,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min。
A.5 无菌生理盐水
A.5.1 成分
氯化钠 8.5g
蒸馏水 1000mL
A.5.2 制法
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
A.6 1mol/LNaOH溶液
A.6.1 成分
NaOH 40.0g
蒸馏水 1000mL
A.6.2 制法
称取40g氢氧化钠溶于1000mL无菌蒸馏水中。
A.7 1mol/LHCl溶液
A.7.1 成分
HCl 90mL
蒸馏水 1000mL
A.7.2 制法
移取浓盐酸90mL,用无菌蒸馏水稀释至1000mL。
附 录 B
大肠菌群最可能数(MPN)检索表
B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
每g(mL)检样中大肠菌群最可能数(MPN)的检索见表B.1。
表B.1 大肠菌群最可能数(MPN)检索表
阳性管数
0.10 0.01 0.001
MPN
95%可信限
下限 上限
阳性管数
0.10 0.01 0.001
MPN
95%可信限
下限 上限
0 0 0 < 3.0 - 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 ......
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