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| 标准编号 | GB 4789.36-2016 (GB4789.36-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验 | | 英文名称 | National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Examination of Escherichia Coli O157:H7/MN | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 13,177 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 4789.36-2008 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | GB 4789.36-2016
National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Examination of Escherichia Coli O157:H7/MN
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验
大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB/T 4789.36-2008《食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》。
本标准与GB/T 4789.36-2008相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验”;
---修改了标准的范围;
---修改了设备和材料;
---修改了培养基和生化反应的文字描述;
---删除“第二法 免疫磁珠捕获法的原理”;
---删除“第三法 全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法”;
---删除“第四法 全自动病原菌检测系统筛选法”。
食品安全国家标准
食品微生物学检验
大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验
1 范围
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
2.2 冰箱:2℃~5℃。
2.3 恒温水浴箱:46℃±1℃。
2.4 天平:感量0.1g、0.01g。
2.5 均质器。
2.6 显微镜:10倍~100倍。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸头。
2.8 无菌均质杯或无菌均质袋:容量500mL。
2.9 无菌培养皿:直径90mm。
2.10 pH计或精密pH试纸。
2.11 长波紫外光灯:365nm,功率≤6W。
2.12 微量离心管:1.5mL或2.0mL。
2.13 磁板、磁板架、样品混合器。
2.14 微生物鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 改良EC肉汤(mEC+n):见A.1。
3.2 改良山梨醇麦康凯琼脂(CT-SMAC):见A.2。
3.3 三糖铁琼脂(TSI):见A.3。
3.4 营养琼脂:见A.4。
3.5 半固体琼脂:见A.5。
3.6 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG(MUG-LST):见A.6。
3.7 氧化酶试剂:见A.7。
3.8 革兰氏染色液:见A.8。
3.9 PBS-Tween20洗液:见A.9。
3.10 亚碲酸钾(AR级)。
3.11 头孢克肟(Cefixime)。
3.12 大肠埃希氏菌O157显色培养基。
3.13 大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂。
3.14 鉴定试剂盒。
3.15 抗-E.coliO157免疫磁珠。
第一法 常规培养法
4 检验程序
大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序见图1。
图1 大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取检样25g(或25mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中,在拍击式均质
器上连续均质1min~2min;或放入盛有225 mL mEC+n肉汤的均质杯中,8000r/min~
10000r/min均质1min~2min。36℃±1℃培养18h~24h。
5.2 分离
取增菌后的 mEC+n肉汤,划线接种于CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上,
36℃±1℃培养18h~24h,观察菌落形态。在CT-SMAC平板上,典型菌落为圆形、光滑、较小的无色
菌落,中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏菌 O157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行
判定。
5.3 初步生化试验
在CT-SMAC和大肠埃希氏菌 O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落,分别接种
TSI琼脂,同时接种 MUG-LST肉汤,并用大肠埃希氏菌株(ATCC25922或等效标准菌株)做阳性对照
和大肠埃希氏菌 O157:H7(NCTC12900或等效标准菌株)做阴性对照,于36℃±1℃培养18h~
24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或
不产气,不产生硫化氢(H2S)。置 MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌
株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌 O157:H7/NM 为 MUG试验阴性,无荧
光。挑取可疑菌落,在营养琼脂平板上分纯,于36℃±1℃培养18h~24h,并进行下列鉴定。
5.4 鉴定
5.4.1 血清学试验
在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落,用O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试
验。对于H7因子血清不凝集者,应穿刺接种半固体琼脂,检查动力,经连续传代3次,动力试验均阴
性,确定为无动力株。如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂,应按照产品说明书进行。
5.4.2 生化试验
5.4.2.1 自营养琼脂平板上挑取菌落,进行生化试验。大肠埃希氏菌O157:H7/NM 生化反应特征见
表1。
表1 大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征
生化试验 特征反应
三糖铁琼脂 底层及斜面呈黄色,H2S阴性
山梨醇 阴性或迟缓发酵
靛基质 阳性
甲基红-伏普试验(MR-VP) MR阳性,VP阴性
氧化酶 阴性
西蒙氏柠檬酸盐 阴性
赖氨酸脱羧酶 阳性(紫色)
鸟氨酸脱羧酶 阳性(紫色)
纤维二糖发酵 阴性
棉子糖发酵 阳性
MUG试验 阴性(无荧光)
动力试验 有动力或无动力
5.4.2.2 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,应从营养琼脂平板上挑取菌落,用稀释液制备成浊
度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
5.4.3 毒力基因测定(可选项目)
样品中检出大肠埃希氏菌O157:H7或O157:NM时,如需要进一步检测Vero细胞毒素基因的存
在,可通过接种Vero细胞或HeLa细胞,观察细胞病变进行判定;也可使用基因探针检测或聚合酶链反
应(PCR)方法进行志贺毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly等基因的检测。如使用试剂盒检测上述基因,应
按照产品的说明书进行。
6 结果报告
综合生化和血清学试验结果,报告25g(或25mL)样品中检出或未检出大肠埃希氏菌 O157:H7
或大肠埃希氏菌O157:NM。
第二法 免疫磁珠捕获法
7 检验程序
大肠埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕获法检验程序见图2。
图2 大肠埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕获法检验程序
8 操作步骤
8.1 增菌
同5.1。
8.2 免疫磁珠捕获与分离
8.2.1 应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离。当生产商的使用说明与下面的描述
可能有偏差时,按生产商提供的使用说明进行。
8.2.2 将微量离心管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用1只微量离心管,然后插入到磁板架
上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠混悬液后,用开盖器打开每个微量离心管的盖子,
每管加入20μLE.coliO157免疫磁珠悬液。
8.2.3 取mEC+n肉汤增菌培养物1mL,加入到微量离心管中,盖上盖子,然后轻微振荡10s。每个
样品更换1只加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,避免交叉污染。
8.2.4 结合:在18℃~30℃环境中,将上述微量离心管连同磁板架放在样品混合器上转动或用手轻微
转动10min,使E.coliO157与免疫磁珠充分接触。
8.2.5 捕获:将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的
免疫磁珠全部被收集起来。此时,在微量离心管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。
8.2.6 吸取上清液:取1支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深入液面,轻轻吸走上清液。当吸到
液面通过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠,则
应将其放回到微量离心管中,并重复8.2.5步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。
免疫磁珠的滑落:某些样品特别是那些富含脂肪的样品,其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上
清液时,很难做到不丢失磁珠,在这种情况下,可保留50μL~100μL上清液于微量离心管中。如果在
后续的洗涤过程中也这样做的话,脂肪的影响将减小,也可达到充分捕获的目的。
8.2.7 洗涤:从磁板架上移走磁板,在每个微量离心管中加入1mLPBS-Tween20洗液,放在样品混合
器上转动或用手轻微转动3min,洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤8.2.5~8.2.7。
8.2.8 重复上述步骤8.2.5~8.2.6。
8.2.9 免疫磁珠悬浮:移走磁板,将免疫磁珠重新悬浮在100μLPBS-Tween20洗液中。
8.2.10 涂布平板:将免疫磁珠混匀,各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和大肠埃希
氏菌O157显色琼脂平板一侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,再用接种环划线接种平
板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于36℃±1℃培养18h~24h。
注:若CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板表面水分过多时,应在36℃±1℃下干燥10min~
20min,涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。
8.3 菌落识别
大肠埃希氏菌O157:H7/NM在CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特
征同5.2。
8.4 初步生化试验
同5.3。
8.5 鉴定
同5.4。
9 结果报告
同第6章。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 改良EC肉汤(mEC+n)
A.1.1 成分
胰蛋白胨 20.0g
3号胆盐 1.12g
乳糖 5.0g
K2HPO4·7H2O 4.0g
KH2PO4 1.5g
NaCl 5.0g
新生霉素钠盐溶液(20mg/mL) 1.0mL
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加热煮沸,在20℃~25℃下校正pH至6.9±0.1,分装。于
121℃高压灭菌15min,备用。制备浓度为20mg/mL的新生霉素储备溶液,过滤法除菌。待培养基温
度冷至50℃以下时,按1000mL培养基内加1mL新生霉素储备液,使最终浓度为20mg/L。
A.2 改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂
A.2.1 山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂
A.2.1.1 成分
蛋白胨 20.0g
山梨醇 10.0g
3号胆盐 1.5g
氯化钠 5.0g
中性红 0.03g
结晶紫 0.001g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
A.2.1.2 制法
除琼脂、结晶紫和中性红外,所有成分溶解在蒸馏水中,加热煮沸,在20℃~25℃下校正pH 至
7.2±0.2,加入琼脂、结晶紫和中性红,煮沸溶解,分装。于121℃高压灭菌15min。
A.2.2 亚碲酸钾溶液
A.2.2.1 成分
亚碲酸钾 0.5g
蒸馏水 200mL
A.2.2.2 制法
将亚碲酸钾溶于水,过滤法除菌。
A.2.3 头孢克肟(Cefixime)溶液
A.2.3.1 成分
头孢克肟 1.0mg
95%乙醇 200mL
A.2.3.2 制法
将头孢克肟溶解于95%乙醇中,静置1h待其充分溶解后过滤除菌。分装试管,储存于-20℃,有
效期1年。解冻后的头孢克肟溶液不应再冻存,且在2℃~8℃下有效期14d。
A.2.4 CT-SMAC制法
取1000mL灭菌融化并冷却至46℃±1℃的山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂,加入1mL亚碲酸钾溶
液和10mL头孢克肟溶液,使亚碲酸钾浓度达到2.5mg/L,头孢克肟浓度达到0.05mg/L,混匀后倾注
平板。
A.3 三糖铁琼脂(TSI)
A.3.1 成分
蛋白胨 20.0g
牛肉浸膏 5.0g
乳糖 10.0g
蔗糖 10.0g
葡萄糖 1.0g
硫酸亚铁铵[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O] 0.2g
氯化钠 5.0g
硫代硫酸钠 0.2g
酚红 0.025g或5.0g/L溶液5.0mL
琼脂 12.0g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加于400mL蒸馏水中,煮沸溶解,在20℃~25℃下校正pH至7.4
±0.2。另将琼脂加于600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,加入5%酚红水溶液5mL,混匀,分装小号试管,每管约2mL~4mL。
于121°C10min或115°C15min,制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用,在2℃~8℃条
件下可储存一个月。
A.4 营养琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 3.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
A.4.2 制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正pH至7.4±0.2,分装。于121℃高压灭菌
15min。
A.5 半固体琼脂
A.5.1 成分
蛋白胨 1.0g
牛肉膏 0.3g
氯化钠 0.5g
琼脂 0.3g~0.4g
蒸馏水 100mL
A.5.2 制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正pH至7.4±0.2,分装小试管,于121℃高压
灭菌15min。直立凝固备用。
A.6 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤-MUG(LST-MUG)
A.6.1 成分
胰蛋白胨 20.0g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾 (K2HPO4) 2.75g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g
十二烷基硫酸钠 0.1g
4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG) 0.1g
蒸馏水 1000mL
A.6.2 制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,于20℃~25℃下校正pH至6.8±0.2,分装到带
有倒管的试管中,每管10mL,于121℃高压灭菌15min。
A.7 氧化酶试剂
A.7.1 成分
N,N'-二甲基对苯二胺盐酸盐
或N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g
蒸馏水 100mL
A.7.2 制法
少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在7d内使用。
A.7.3 试验方法
用无菌棉拭子取单个菌落,滴加氧化酶试剂,10s内呈现粉红或紫红色,即为氧化酶试验阳性。不
变色者为氧化酶试验阴性。
A.8 革兰氏染色液
A.8.1 结晶紫染色液
A.8.1.1 成分
结晶紫 1.0g
95%乙醇 20mL
1%草酸铵水溶液 80mL
A.8.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵......
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