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GB 4789.4-2010

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基本信息
标准编号 GB 4789.4-2010 (GB4789.4-2010)
中文名称 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
英文名称 National food safety standard. Food microbiological examination: Salmonella
行业 国家标准
中标分类 C53
国际标准分类 07.100.30
字数估计 21,268
发布日期 2010-03-26
实施日期 2010-06-01
旧标准 (被替代) GB/T 4789.4-2008
标准依据 卫生部通告卫通(2010)7号;国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号
发布机构 中华人民共和国卫生部
范围 本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。

GB 4789.4-2010: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
GB 4789.4-2010 英文名称: National food safety standard -- Food microbiological examination: Salmonella
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
5 操作步骤
5.1 前增菌
称取 25 g(mL)样品放入盛有 225 mL BPW 的无菌均质杯中,以 8 000 r/min~10 000 r/min 均质
1 min~2 min,或置于盛有 225 mL BPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打 1 min~2 min。若样
品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需测定 pH 值,用 1 mol/mL 无菌 NaOH 或 HCl 调 pH 至 6.8±0.2。检样
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取 1 mL,转种于 10 mL TTB 内,于 42 ℃±1 ℃培养 18 h~24
h。同时,另取 1 mL,转种于 10 mL SC 内,于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h。
5.3 分离
分别用接种环取增菌液 1 环,划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板(或 HE 琼脂
平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h~24 h (XLD 琼脂平板、HE 琼脂
平板、沙门氏菌属显色培养基平板) 或 40 h~48 h (BS 琼脂平板),观察各个平板上生长的菌落,
各个平板上的菌落特征见表 1。
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,
再于底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于 36 ℃±1 ℃
培养 18 h~24 h,必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属
的反应结果见表 2。
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 (供做靛基质试
验)、尿素琼脂 (pH7.2)、氰化钾 (KCN) 培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑
取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h,必要时可延长至 48 h,按表 3 判定结果。将已挑菌
落的平板储存于 2 ℃~5 ℃或室温至少保留 24 h,以备必要时复查。
5.4.2.1 反应序号 A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1
项异常,按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。
5.4.2.2 反应序号 A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳
性,但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号 A3:补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒
沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据 5.4.1 的初步判断结果,从营
养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动
微生物生化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 抗原的准备
一般采用 1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。
O 血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的 (如 2%~3%) 培养基上再检查;如果是由于
Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时,可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰
上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时,将菌株接种在 0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,俟菌落
蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过装有 0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管 1 次~2
次,自远端取菌培养后再检查。
5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域,挑取 1 环待测菌,各放 1/2 环于玻片上的每一区域上
部,在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入 1 滴生理盐水,作为对
照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min,并对
着黑暗背景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。
5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定同 5.5.2。
5.5.4 血清学分型(选做项目)
5.5.4.1 O 抗原的鉴定
用 A~F 多价 O 血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形
菌株,不能分型。
被 A~F 多价 O 血清凝集者,依次用 O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2 和 O11 因子血清做凝集
试验。根据试验结果,判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株,再用 O10、O15、O34、O19 单因
子血清做凝集试验,判定 E1、E2、E3、E4 各亚群,每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因
子血清的检查结果,没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。
不被 A~F 多价 O 血清凝集者,先用 9 种多价 O 血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种
血清所包括的 O 群血清逐一检查,以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下:
5.5.4.2 H 抗原的鉴定
属于 A~F 各 O 群的常见菌型,依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。
每一个 H 抗原成分的最后确定均应根据 H 单因子血清的检查结果,没有 H 单因子血清的要用两
个 H 复合因子血清进行核对。
检出第 1 相 H 抗原而未检出第 2 相 H 抗原的或检出第 2 相 H 抗原而未检出第 1 相 H 抗原的,可
在琼脂斜面上移种 1~2 代后再检查。如仍只检出一个相的 H 抗原,要用位相变异的方法检查其另一
个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下:
小玻管法: 将半固体管(每管约 1 mL~2 mL) 在酒精灯上溶化并冷至 50 ℃,取已知相的 H
因子血清 0.05 mL~0.1 mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试
验的小玻管内,俟凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁
放一团湿棉花,以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端
挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细
菌的动力不能抑制。一般按原血清 1:200~1:800 的量加入。
小倒管法:将两端开口的小玻管 (下端开口要留一个缺口,不要平齐) 放在半固体管内,小玻
管的上端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至 50 ℃,挑取因子
血清 1 环,加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,俟凝固后,将待检菌株接种于小套管
中的半固体表层内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或
转种 1%软琼脂斜面,于 37 ℃培养后再做凝集试验。
简易平板法:将 0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清 1 环,滴在半固体
平板表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓
延生长的菌苔边缘取菌检查。
5.5.4.3 Vi 抗原的鉴定
用 Vi 因子血清检查。已知具有 Vi 抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙门氏菌。
5.5.4.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果,按照附录 B 或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25 g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。
附录A
(规范性附录)
培养基和试剂
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.2 制法
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约 10 min,煮沸溶解,调节 pH,高压灭菌 121 ℃,15min。
A.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
A.2.1 基础液
A.2.2 硫代硫酸钠溶液
A.2.3 碘溶液
A.2.4 0.5%煌绿水溶液
A.2.5 牛胆盐溶液
A.2.6 制法
A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1 成分
A.3.2 制法
除亚硒酸氢钠和 L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至 55 ℃以下,以无菌操作
加入亚硒酸氢钠和 1 g/L L-胱氨酸溶液 10 mL(称取 0.1 g L-胱氨酸,加 1 mol/L 氢氧化钠溶液 15 mL,
使溶解,再加无菌蒸馏水至 100 mL 即成,如为 DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节 pH。
A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂
A.4.2 制法
将前三种成分加入 300 mL 蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入 20 mL 和 30
mL 蒸馏水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一 20 mL 和 30 mL 蒸馏水中,琼脂加入 600 mL 蒸
馏水中。然后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至 80 ℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入
基础液中,混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节 pH,随即倾入琼脂
液中,混合均匀,冷至 50 ℃~55 ℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过 48 h 会
降低其选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.6.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入 400 mL 蒸馏水中,煮沸溶解,调节 pH。另将琼脂加入 600 mL
蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至 50 ℃~55 ℃倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。
本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.10.3 试验方法
将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液,挑取 1 环接种于氰化钾(KCN)培养基。并另
挑取 1 环接种于对照培养基。在 36 ℃±1 ℃培养 1 d~2 d,观察结果。如有细菌生长即为阳性(不抑
制),经 2 d 细菌不生长为阴性(抑制)。
注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心,切勿沾染,以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要
原因是封口不严,氰化钾逐渐分解,产生氢氰酸气体逸出,以致药物浓度降低,细菌生长,因而造成假阳性反应。试
验时对每一环节都要特别注意。
A.11.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于 36 ℃±1 ℃培养 18 h~24 h,观察结果。氨基酸脱羧酶阳性者
由于产碱,培养基应呈紫色。......
   
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