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GB 4789.4-2016

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基本信息
标准编号 GB 4789.4-2016 (GB4789.4-2016)
中文名称 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
英文名称 National food safety standard -- Food microbiological examination -- Salmonella Test
行业 国家标准
中标分类 X09
字数估计 22,275
发布日期 2016-12-23
实施日期 2017-06-23
旧标准 (被替代) GB 4789.4-2010; SN 0170-1992; SN/T 2552.5-2010
标准依据 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号

GB 4789.4-2016
National food safety standard Food microbiological examination: Salmonella
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替 GB 4789.4-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、
SN0170-1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T 2552.5-2010《乳及乳制品卫
生微生物学检验方法 第5部分:沙门氏菌检验》。
整合后的标准与GB 4789.4-2010相比,主要变化如下:
---修改了检测流程和血清学检测操作程序;
---修改了附录A和附录B。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 冰箱:2℃~5℃。
2.2 恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 电子天平:感量0.1g。
2.6 无菌锥形瓶:容量500mL,250mL。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.8 无菌培养皿:直径60mm,90mm。
2.9 无菌试管:3mm×50mm、10mm×75mm。
2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.11 全自动微生物生化鉴定系统。
2.12 无菌毛细管。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见A.2。
3.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见A.3。
3.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:见A.4。
3.5 HE琼脂:见A.5。
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见A.6。
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 三糖铁(TSI)琼脂:见A.7。
3.9 蛋白胨水、靛基质试剂:见A.8。
3.10 尿素琼脂(pH7.2):见A.9。
3.11 氰化钾 (KCN)培养基:见A.10。
3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.11。
3.13 糖发酵管:见A.12。
3.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见A.13。
3.15 半固体琼脂:见A.14。
3.16 丙二酸钠培养基:见A.15。
3.17 沙门氏菌O、H和Vi诊断血清。
3.18 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图1。
图1 沙门氏菌检验程序
5 操作步骤
5.1 预增菌
无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW的无菌均质杯或合适容器内,以8000r/min~
10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打
1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,用1mol/mL无菌 NaOH 或
HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无
孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。
如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。
同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。
5.3 分离
分别用直径3mm的接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE
琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h
(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板
上的菌落特征见表1。
表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板 沙门氏菌
BS琼脂
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿
色的菌落,周围培养基不变
HE琼脂 蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色
XLD琼脂
菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心,或呈现全部黑色
的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心
沙门氏菌属显色培
养基
按照显色培养基的说明进行判定
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于
底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36℃±1℃培养
18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结
果见表2。
表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
三糖铁琼脂
斜面 底层 产气 硫化氢
赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断
K A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属
K A +(-) +(-) - 可疑沙门氏菌属
A A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属
A A +/- +/- - 非沙门氏菌
K K +/- +/- +/- 非沙门氏菌
注:K:产碱,A:产酸;+:阳性,-:阴性;+(-):多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性。
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、
尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接
种。于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存
于2℃~5℃或室温至少保留24h,以备必要时复查。
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应序号 硫化氢 (H2S) 靛基质 pH7.2尿素 氰化钾(KCN) 赖氨酸脱羧酶
A1 + - - - +
A2 + + - - +
A3 - - - - +/-
注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。
5.4.2.1 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异
常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2尿素 氰化钾(KCN) 赖氨酸脱羧酶 判定结果
- - -
甲型副伤寒沙门氏菌(要
求血清学鉴定结果)
- + +
沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符
合本群生化特性)
+ - +
沙门氏菌个别变体(要求
血清学鉴定结果)
注:+表示阳性;-表示阴性。
5.4.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但
需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙
门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别
项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
卫矛醇 + + - - + -
山梨醇 + + + + + -
水杨苷 - - - + - -
ONPG - - + - + -
丙二酸盐 - + + - - -
KCN - - - + + -
注:+表示阳性;-表示阴性。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼
脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生
化鉴定系统进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 检查培养物有无自凝性
一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的
玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻
摇动30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自
凝性,反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。
5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,
在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用
无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min,并对着黑暗背
景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如
2%~3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生
理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定
操作同5.5.2。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,待菌落
蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~
2次,自远端取菌培养后再检查。
5.6 血清学分型(选做项目)
5.6.1 O抗原的鉴定
用A~F多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌
株,不能分型。
被A~F多价O血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验。
根据试验结果,判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集
试验,判定E1、E4各亚群,每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果,没有O
单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A~F多价O血清凝集者,先用9种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清
所包括的O群血清逐一检查,以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下:
O多价1 A,B,C,D,E,F群 (并包括6,14群)
O多价2 13,16,17,18,21群
O多价3 28,30,35,38,39群
O多价4 40,41,42,43群
O多价5 44,45,47,48群
O多价6 50,51,52,53群
O多价7 55,56,57,58群
O多价8 59,60,61,62群
O多价9 63,65,66,67群
5.6.2 H抗原的鉴定
属于A~F各O群的常见菌型,依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
表6 A~F群常见菌型 H抗原表
O群 第1相 第2相
C1
C2
D(不产气的)
D(产气的)
E1
E4
E4
g,f,s
i,b,d
k,v,r,c
b,d,r
g,m,p,q
h,v
g,s,t
5,z15
2,5
6,w,x
不常见的菌型,先用8种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血
清所包括的各种H因子血清逐一检查,以第1相和第2项的 H抗原。8种多价 H血清所包括的 H因
子如下:
H多价1 a,b,c,d,i
H多价2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H多价3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H多价5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H多价6 z39,z41,z42,z44
H多价7 z52,z53,z54,z55
H多价8 z56,z57,z60,z61,z62
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果,没有 H单因子血清的要用两
个H复合因子血清进行核对。
检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可
在琼脂斜面上移种1代~2代后再检查。如仍只检出一个相的 H抗原,要用位相变异的方法检查其另
一个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下:
简易平板法:将0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板
表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌
苔边缘取菌检查。
小玻管法:将半固体管(每管约1mL~2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃,取已知相的 H因子血
清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻
管内,待凝固后,用接种针挑取待检菌,接种于一端。将小玻管平放在平皿内,并在其旁放一团湿棉花,
以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。
培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般
按原血清1∶200~1∶800的量加入。
小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上
端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50℃,挑取因子血清1环,
加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,待凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层
内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,
于36℃培养后再做凝集试验。
5.6.3 Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有:伤寒沙门氏菌,丙型副伤寒沙门氏菌,都柏林沙
门氏菌。
5.6.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果,按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水) 9.0g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,高压灭菌121℃,
15min。
A.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
A.2.1 基础液
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 5.0g
氯化钠 3.0g
碳酸钙 45.0g
蒸馏水 1000mL
除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH至7.0±0.2,高压灭菌121℃,
20min。
A.2.2 硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠(含5个结晶水) 50.0g
蒸馏水 加至100mL
高压灭菌121℃,20min。
A.2.3 碘溶液
碘 片 20.0g
碘化钾 25.0g
蒸馏水 加至100mL
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水
至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。
A.2.4 0.5%煌绿水溶液
煌绿 0.5g
蒸馏水 100mL
溶解后,存放暗处,不少于1d,使其自然灭菌。
A.2.5 牛胆盐溶液
牛胆盐 10.0g
蒸馏水 100mL
加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121℃,20min。
A.2.6 制法
基础液 900mL
硫代硫酸钠溶液 100mL
碘溶液 20.0mL
煌绿水溶液 2.0mL
牛胆盐溶液 50.0mL
临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种
成分。
A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨 5.0g
乳糖 4.0g
磷酸氢二钠 10.0g
亚硒酸氢钠 4.0g
L-胱氨酸 0.01g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55℃以下,以无菌操作加入
亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液15mL,使溶
解,再加无菌蒸馏水至100mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH至7.0±0.2。
A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 5.0g
葡萄糖 5.0g
硫酸亚铁 0.3g
磷酸氢二钠 4.0g
煌绿 0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL
柠檬酸铋铵 2.0g
亚硫酸钠 6.0g
琼脂 18.0g~20.0g
蒸馏水 1000mL
A.4.2 制法
将前三种成分加入300mL蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏
水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中,琼脂加入600mL蒸馏水中。然
后分别搅拌均匀,煮沸溶解。冷至80℃左右时,先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀,倒入基础液中,混匀。
将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH至7.5±0.2,随即倾入琼脂液中,混合
均匀,冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48h会降低其
选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.5 HE 琼脂(HektoenEntericAgar)
A.5.1 成分
蛋白胨 12.0g
牛肉膏 3.0g
乳糖 12.0g
蔗糖 12.0g
水杨素 2.0g
胆盐 20.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 18.0g~20.0g
蒸馏水 1000mL
0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16.0mL
Andrade指示剂 20.0mL
甲液 20.0mL
乙液 20.0mL
A.5.2 制法
将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别
搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH至7.5±0.2。再加入指示剂,并与琼脂液
合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠 34.0g
柠檬酸铁铵 4.0g
蒸馏水 100mL
③乙液的配制
去氧胆酸钠 10.0g
蒸馏水 100mL
④Andrade 指示剂
酸性复红 0.5g
1mol/L氢氧化钠溶液 16.0mL
蒸馏水 100mL
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1mL~
2mL。
A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
A.6.1 成分
酵母膏 3.0g ......
   
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