| 标准编号 | GB 4789.4-2024 (GB4789.4-2024) | | 中文名称 | 食品安全国家标准--食品微生物学检验--沙门氏菌检验 | | 英文名称 | National Food Safety Standards--Food Microbiological Testing--Salmonella Testing | | 行业 | 国家标准 | | 字数估计 | 24,222 | | 发布日期 | 2024/2/8 | GB 4789.4-2024中文版：食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
GB 4789.4-2024英文版：National Food Safety Standards--Food Microbiological Testing--Salmonella Testing
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
2024-02-08发布
2024-08-08实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB 4789.4-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》。
本标准与GB 4789.4-2016相比,主要变化如下:
---修改了设备和材料、培养基和试剂;
---修改了检验程序和操作步骤;
---修改了附录A和附录B。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。
2.1 冰箱:2℃~8℃。
2.2 恒温培养箱:36℃±1℃,恒温装置:42℃±1℃、48℃±2℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 天平:感量0.1g。
2.6 无菌锥形瓶:容量500mL、250mL。
2.7 无菌量筒:容量50mL。
2.8 无菌均质杯、无菌均质袋。
2.9 无菌广口瓶:容量500mL。
2.10 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.11 无菌培养皿:直径60mm、90mm。
2.12 无菌试管:10mm×75mm、15mm×150mm、18mm×180mm或其他合适规格。
2.13 无菌小玻管:3mm×50mm。
2.14 无菌接种环:10μL(直径约3mm)、1μL以及接种针。
2.15 pH计或精密pH试纸。
2.16 微生物生化鉴定系统。
2.17 生物安全柜。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB):见A.2。
3.3 氯化镁孔雀绿大豆胨(RVS)增菌液:见A.3。
3.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:见A.4。
3.5 HE琼脂:见A.5。
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见A.6。
3.7 三糖铁(TSI)琼脂:见A.7。
3.8 营养琼脂(NA):见A.8。
3.9 半固体琼脂:见A.9。
3.10 蛋白胨水、靛基质试剂:见A.10。
3.11 尿素琼脂(pH7.2):见A.11。
3.12 氰化钾(KCN)培养基:见A.12。
3.13 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.13。
3.14 糖发酵培养基:见A.14。
3.15 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见A.15。
3.16 丙二酸钠培养基:见A.16。
3.17 沙门氏菌显色培养基。
3.18 沙门氏菌诊断血清。
3.19 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
5 操作步骤
5.1 预增菌
无菌操作取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW的无菌均质杯中,以8000r/min~10000r/min
均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW 的无菌均质袋内,用拍击式均质器拍打1min~2min。
对于液态样品,也可置于盛有225mLBPW 的无菌锥形瓶或其他合适容器中振荡混匀。如需调节pH
时,用1mol/LNaOH或HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容
器内(如均质杯本身具有无孔盖或使用均质袋时,可不转移样品),置于36℃±1℃培养8h~18h。
对于乳粉,无菌操作称取25g样品,缓缓倾倒在广口瓶或均质袋内225mLBPW的液体表面,勿调
节pH,也暂不混匀,室温静置60min±5min后再混匀,置于36℃±1℃培养16h~18h。
冷冻样品如需解冻,取样前在40℃~45℃的水浴中解冻不超过15min,或在2℃~8℃冰箱缓慢
化冻不超过18h。
5.2 选择性增菌
轻轻摇动预增菌的培养物,移取0.1mL转种于10mLRVS中,混匀后于42℃±1℃培养18h~
24h。同时,另取1mL转种于10mLTTB中后混匀,低背景菌的样品(如深加工的预包装食品等)置
于36℃±1℃培养18h~24h,高背景菌的样品(如生鲜禽肉等)置于42℃±1℃培养18h~24h。
如有需要,可将预增菌的培养物在2℃~8℃冰箱保存不超过72h,再进行选择性增菌。
5.3 分离
振荡混匀选择性增菌的培养物后,用直径3mm的接种环取每种选择性增菌的培养物各一环,分别
划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(也可使用 HE琼脂平板、沙门氏菌显色培养基平
板或其他合适的分离琼脂平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h(XLD
琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,是否符合表1的菌
落特征。
如有需要,可将选择性增菌的培养物在2℃~8℃冰箱保存不超过72h,再进行分离。
5.4 生化试验
5.4.1 挑取4个以上典型或可疑菌落进行生化试验,这些菌落宜分别来自不同选择性增菌液的不同分
离琼脂;也可先选其中一个典型或可疑菌落进行试验,若鉴定为非沙门氏菌,再取余下菌落进行鉴定。
将典型或可疑菌落接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于底层穿刺;同时接种赖氨酸脱羧酶试验培养基
和营养琼脂(或其他合适的非选择性固体培养基)平板,于36℃±1℃培养18h~24h。三糖铁和赖氨
酸脱羧酶试验的结果及初步判断见表2。将已挑菌落的分离琼脂平板于2℃~8℃保存,以备必要时
复查。
5.4.2 初步判断为非沙门氏菌者,直接报告结果。对疑似沙门氏菌者,从营养琼脂平板上挑取其纯培
养物接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在接种三糖铁琼
脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,接种以上3种生化试验培养基,于36℃±1℃培养18h~24h,
按表3判定结果。
5.4.2.1 符合表3中A1者,为沙门氏菌典型的生化反应,进行血清学鉴定后报告结果。尿素、氰化钾
和赖氨酸脱羧酶中如有1项不符合A1,按表4进行结果判断;尿素、氰化钾和赖氨酸脱羧酶中如有2项
不符合A1,判断为非沙门氏菌并报告结果。
5.4.2.2 生化试验结果符合表3中A2者,补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌(靛基质阳性变体)的甘
露醇和山梨醇试验结果均为阳性,其结果报告还需进行血清学鉴定。
5.4.2.3 生化试验结果符合表3中A3者,补做ONPG试验。沙门氏菌的ONPG试验结果为阴性,且
赖氨酸脱羧酶试验结果为阳性,但甲型副伤寒沙门氏菌的赖氨酸脱羧酶试验结果为阴性。生化试验结
果符合沙门氏菌者,进行血清学鉴定。
5.4.2.4 必要时,按表5进行沙门氏菌种和亚种的生化鉴定。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,用分离平板上典型或可疑菌落的纯培养物,或
者根据表2初步判断为疑似沙门氏菌的纯培养物,按生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统的操作说
明进行鉴定。
5.5 血清学鉴定
5.5.1 培养物自凝性检查
一般采用琼脂含量为1.2%~1.5%的纯培养物进行玻片凝集试验。首先进行自凝性检查,在洁净
的玻片上滴加一滴生理盐水,取适量待测菌培养物与之混合,成为均一性的浑浊悬液,将玻片轻轻摇动
30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自凝性,
反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。
5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出两个约1cm×2cm的区域,挑取待测菌培养物,各放约一环于玻片上的每一区域上
部,在其中一个区域下部加一滴多价菌体(O)血清,在另一区域下部加入一滴生理盐水,作为对照。再
用无菌的接种环或针将两个区域内的待测菌培养物,分别与血清和生理盐水研成乳状液。将玻片倾斜
摇动混合1min,并对着黑暗背景进行观察,与对照相比,出现可见的菌体凝集者为阳性反应。O血清
不凝集时,将菌株接种在琼脂含量较高(如2%~3%)的培养基上培养后再鉴定,如果是由于Vi抗原的
存在而阻止了O血清的凝集反应时,可挑取待测菌培养物在1mL生理盐水中制成浓菌液,在沸水中水
浴20min~30min,冷却后再进行鉴定。
注:不同厂商沙门氏菌诊断血清的组成、鉴定操作及结果判断,可能存在差异。使用商品化的沙门氏菌诊断血清进
行血清学鉴定时,应遵循其产品说明。
5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定
按5.5.2的操作,将多价菌体(O)血清换成多价鞭毛(H)血清,进行多价鞭毛抗原(H)鉴定。H抗
原发育不良时,将菌株接种在半固体琼脂平板的中央,待菌落蔓延生长时,在其边缘部分取菌鉴定;或将
菌株接种在装有半固体琼脂的小玻管培养1代~2代,自远端取菌再进行鉴定。
5.6 血清学分型(选做项目)
5.6.1 O抗原的鉴定
用A~F多价O血清做玻片凝集试验,同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌
株,不能分型。
被A~F多价O血清凝集者,依次用O4、O3,10、O7、O8、O9、O2和O11因子血清做凝集试验。根
据试验结果,判定O群。被O3,10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验,
判定E1、E4各亚群。根据O单因子血清的鉴定结果,确定每个O抗原成分。没有O单因子血清的,用
两个O复合因子血清进行鉴定。
5.6.2 H抗原的鉴定
属于A~F各O群的常见菌型,依次用表6所述H因子血清鉴定第1相和第2相的H抗原。
5.6.2.1 简易平板法
将半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取已知相的H因子血清1环,滴在半固体平板表面,正置平板
片刻待血清吸收,在滴加血清部位的中央点种待测菌株,翻转平板置于36℃±1℃培养后,在形成蔓延
生长的菌苔边缘取菌鉴定。
5.6.2.2 小玻管法
将1mL~2mL半固体琼脂熔化后冷却至48℃左右,加入已知相的 H 因子血清0.05mL~
0.1mL,混匀后装入3mm×50mm两端开口的小玻管内。待琼脂凝固后,用接种针挑取待测菌,接种
于小玻管一端的琼脂内。将小玻管平放在平皿内,置于36℃±1℃培养,并采取保湿措施以防琼脂中
水分蒸发而干缩。每天观察结果,待另一相细菌解离后,从小玻管另一端挑取细菌进行鉴定。培养基内
血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清
1∶(200~800)的量加入。
5.6.2.3 小套管法
在装有大约10mL半固体琼脂培养基的试管中,插入3mm×50mm两端开口的......
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