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GB 4789.42-2016 English:
GB 4789.42-2016 GB 4789.42-2016: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验
GB 4789.42-2016 英文名称: Detection of norovirus in shellfish -- Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR
1 范围
本标准规定了食品中诺如病毒(Norovirus)的实时荧光RT-PCR检测方法。
本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品,草莓、西红柿、葡萄等软质水果等
食品中诺如病毒核酸的检测。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 实时荧光PCR仪。
2.2 冷冻离心机。
2.3 无菌刀片或等效均质器。
2.4 涡旋仪。
2.5 天平:感量为0.1g。
2.6 振荡器。
2.7 水浴锅。
2.8 离心机。
2.9 高压灭菌锅。
2.10 低温冰箱:-80℃。
2.11 微量移液器。
2.12 pH计或精密pH试纸。
2.13 网状过滤袋:400mL。
2.14 无菌棉拭子。
2.15 无菌贝类剥刀。
2.16 橡胶垫。
2.17 无菌剪刀。
2.18 无菌钳子。
2.19 无菌培养皿。
2.20 无RNase玻璃容器:见E.1.2。
2.21 无RNase离心管、无RNase移液器吸嘴、无RNase药匙、无RNasePCR薄壁管:见E.1.3。
3 试剂
除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无RNase超纯水:见E.2.1。
3.1 GⅠ、GⅡ基因型诺如病毒的引物、探针:见A.1。
3.2 过程控制病毒的引物、探针:见A.1。
3.3 过程控制病毒:制备见附录C。
3.4 外加扩增控制RNA:制备见附录D。
3.5 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGB E)缓冲液:见E.2.2。
3.6 5×PEG/NaCl溶液(500g/L聚乙二醇PEG8000,1.5mol/LNaCl):见E.2.3。
3.7 磷酸盐缓冲液(PBS):见E.2.4。
3.8 氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5。
3.9 蛋白酶K溶液:见E.2.6。
3.10 75%乙醇:见E.2.7。
3.11 Trizol试剂:见E.2.8。
4 检验程序
诺如病毒检验程序见图1。
5 操作步骤
5.1 病毒提取
注:样品处理一般应在4℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将样品保存在-80℃冰箱中,试验前解冻。样品处理和PCR反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可设置2~3个平行处理。
5.1.1 软质水果和生食蔬菜
5.1.1.1 将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块(如水果或蔬菜小于该体
积,可不切)。
5.1.1.2 将样品小块移至带有400mL网状过滤袋的样品袋,加入40mLTGB E溶液(软质水果样品,
需加入30UA.niger果胶酶,或1140UA.aculeatus果胶酶),加入10μL过程控制病毒。
5.1.1.3 室温,60次/min,振荡20min。酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10min检测pH,如pH
低于9.0时,使用1mol/LNaOH调pH至9.5,每调整一次pH,延长振荡时间10min。
5.1.1.4 将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管。10000r/min,4℃,离心30min。
取上清至干净试管或三角瓶,用1mol/LHCl调pH至7.0。
5.1.1.5 加入0.25倍体积5×PEG/NaCl溶液,使终溶液浓度为100g/LPEG,0.3mol/LNaCl。60s
摇匀,4℃,60次/min,振荡60min。10000r/min,4℃,离心30min,弃上清。10000r/min,4℃,离
心5min紧实沉淀,弃上清。
5.1.1.6 500μLPBS悬浮沉淀。如食品样品为生食蔬菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记
录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中。加入
500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5min。10000r/min,4℃,离心15min,将液相部分仔
细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。
5.1.2 硬质表面食品
5.1.2.1 将无菌棉拭子使用PBS湿润后,用力擦拭食品表面(< 100cm2)。记录擦拭面积。将10μL
过程控制病毒添加至该棉拭子。
5.1.2.2 将棉拭子浸入含490μLPBS试管中,紧贴试管一侧挤压出液体。如此重复浸入和挤压3~4次,
确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续RNA提取。硬质食品表面过于粗糙,可
能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子。
5.1.3 贝类
5.1.3.1 戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类。
5.1.3.2 使用无菌剪刀、手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培
养皿中。收集2.0g。
5.1.3.3 使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管。加入10μL过程控制病毒。加
入2.0mL蛋白酶K溶液,混匀。
5.1.3.4 使用恒温摇床或等效装置,37℃,320次/min,振荡60min。
5.1.3.5 将试管放入水浴或等效装置,60℃,15min。室温,3000r/min,5min离心,将上清液转移至
干净试管,测定并记录上清液mL数,用于后续RNA提取。
5.2 病毒RNA提取和纯化
注:病毒RNA可手工提取和纯化,也可使用商品化病毒RNA提取纯化试剂盒。提取完成后,为延长RNA保存时间可选择性加入RNase抑制剂。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换。提取出来的RNA立即进行反应,或保存在4℃小于8h。如果长期储存建议-80℃保存。
5.2.1 病毒裂解
将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积Trizol试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5min,加入
0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀30s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12000r/min,离
心5min,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层。
5.2.2 病毒RNA提取
离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5min,12000r/min,离心5min,弃上清,倒置于
吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。
5.2.3 病毒RNA纯化
5.2.3.1 每次加入等体积75%乙醇,颠倒洗涤RNA沉淀2次。
5.2.3.2 于4℃,12000r/min,离心10min,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸
水纸不同地方沾干)。或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰
到有沉淀,室温干燥3min,不能过于干燥,以免RNA不溶。
5.2.3.3 加入16μL无RNase超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min,离心5s,冰上保存
备用。
5.3 质量控制
5.3.1 空白对照
以无RNase超纯水作为空白对照(A反应孔)。
5.3.2 阴性对照
以不含有诺如病毒的贝类,提取RNA,作为阴性对照(B反应孔)。
5.3.3 阳性对照
以外加扩增控制RNA,作为阳性对照(J反应孔)。
5.3.4 过程控制病毒
5.3.4.1 以食品中过程控制病毒RNA的提取效率表示食品中诺如病毒RNA的提取效率,作为病毒提
取过程控制。
5.3.4.2 将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化RNA。可大量提取,分装为10μL过程控制病毒的
RNA量,-80℃保存,每次检测时取出使用。
5.3.4.3 将10μL过程控制病毒的RNA进行数次10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒
引物、探针,采用与诺如病毒实时荧光RT-PCR反应相同的反应条件确定未稀释和梯度稀释过程病毒
RNA的Ct值。
5.3.4.4 以未稀释和梯度稀释过程控制病毒RNA的浓度lg值为X 轴,以其Ct值为Y 轴,建立标准曲
线;标准曲线r2 应≥0.98。未稀释过程控制病毒RNA浓度为1,梯度稀释过程控制RNA浓度分别为
10-1、10-2、10-3等。
5.3.4.5 将含过程控制病毒食品样品RNA(C反应孔),加入过程控制病毒引物、探针,采用诺如病毒实
时荧光RT-PCR反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反应,确定Ct值,代入标准曲线,
计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒RNA浓度。
5.3.4.6 计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒 RNA 浓度×100%,即
(C反应孔)Ct值对应浓度×100%。
5.3.5 外加扩增控制
5.3.5.1 通过外加扩增控制RNA,计算扩增抑制指数,作为扩增控制。
5.3.5.2 外加扩增控制RNA分别加入含过程控制病毒食品样品RNA(H反应孔)、10-1稀释的含过程
控制病毒食品样品RNA(I反应孔)、无RNase超纯水(J反应孔),加入GⅠ或GⅡ型引物探针,采用附
录C反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反应,确定Ct值。
5.3.5.......