标准搜索结果: 'GB 4789.42-2025'
| 标准编号 | GB 4789.42-2025 (GB4789.42-2025) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验 | | 英文名称 | National food safety standard - Food microbiological examination - Examination of Norwalk Viruses | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 18,187 | | 发布日期 | 2025-03-16 | | 实施日期 | 2025-09-16 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生健康委员会、国家市场监督管理总局 | GB 4789.42-2025: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 诺如病毒检验
2025-03-16发布
2025-09-16实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB 4789.42-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》。
本标准与GB 4789.42-2016相比,主要变化如下:
---修改了标准的适用范围;
---增加了过程控制病毒和诺如病毒GⅠ基因组检测用探针;
---修改了“软质水果和生食蔬菜”的前处理步骤和检验结果的判定。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 诺如病毒检验
1 范围
本标准规定了食品中诺如病毒(Norovirus)的实时荧光RT-PCR检验方法。
本标准适用于贝类、生食蔬菜、硬质表面食品、软质水果和包装饮用水中诺如病毒的检测。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。
2.1 实时荧光PCR仪。
2.2 低温离心机:离心力 >12000×g,温度≤4℃,套管容积适合1.5mL/50mL离心管。
2.3 无菌刀片或等效均质器。
2.4 涡旋混匀仪。
2.5 电子天平:感量为0.1g和0.1mg。
2.6 全温振荡器或等效装置:温度范围2℃~60℃。
2.7 恒温水浴锅或恒温金属浴:温度范围为室温~100℃。
2.8 离心机:离心力 >5000×g,套管容积适合50mL/15mL离心管。
2.9 低温冰箱:-80℃。
2.10 微量移液器。
2.11 pH计或精密pH试纸。
2.12 无菌均质袋:带滤网,容积400mL。
2.13 无菌棉拭子。
2.14 无菌贝类剥刀。
2.15 橡胶垫。
2.16 无菌剪刀。
2.17 无菌镊子。
2.18 无菌培养皿。
2.19 无RNase玻璃容器、无RNase离心管、无RNase移液器吸头、无RNase药匙、无RNasePCR薄
壁管:见附录E中E.1。
2.20 超滤浓缩离心管(截留蛋白分子量50kD或100kD)。
2.21 无菌混合纤维素膜(孔径0.45μm,直径47mm)。
3 培养基和试剂
除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无RNase超纯水(见E.2.1)。
3.1 GⅠ和GⅡ基因组诺如病毒引物和探针:见附录A。
3.2 过程控制病毒引物和探针:见附录C。
3.3 过程控制病毒:门哥病毒或大肠埃希氏菌噬菌体 MS2,见附录C。
3.4 外加扩增控制RNA:见附录D。
3.5 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGB E)缓冲液:见E.2.2。
3.6 5×PEG/NaCl溶液:见E.2.3。
3.7 磷酸盐缓冲液(PBS):见E.2.4。
3.8 三氯甲烷/正丁醇混合液:见E.2.5。
3.9 蛋白酶K溶液:见E.2.6。
3.10 75%乙醇:见E.2.7。
3.11 Trizol试剂:见E.2.8。
3.12 盐酸(HCl)溶液(6mol/L):见E.2.9。
3.13 氢氧化钠(NaOH)溶液(1mol/L):见E.2.10。
3800U/mL。
3.15 氯化镁。
4 检验程序
诺如病毒检验程序见图1。
图1 诺如病毒检验程序
5 操作步骤
5.1 样品处理
待检样品一般应在4℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测,如果在24h
内不能检测,应将样品保存在-80℃冰箱中,实验前取出,放置室温,至样品完全解冻。样品处理和
PCR检测应防止交叉污染。每个样品可设置2个~3个平行处理。样品处理过程中,要注意更换剪刀、
镊子、移液器吸头等实验耗材,防止样品间的交叉污染。
5.2 病毒提取
5.2.1 软质水果和生食蔬菜
5.2.1.1 将25g软质水果(由子房发育成的柔软多汁的肉质水果的统称,如草莓、葡萄)或生食蔬菜(如
生菜)在无菌条件下切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm 的小块(如水果或蔬菜小于该体积,可不切)。
5.2.1.2 将样品小块移至无菌均质袋(带滤网,容积400mL)中,加入10μL过程控制病毒,再加入40mL
胶酶)。
5.2.1.3 使用全温振荡器,在室温条件下,60次/min,振荡20min。酸性软质水果(软果经焚烧后的灰
分溶解在水中后pH小于7.0的软质水果,例如草莓、杨梅、覆盆子)需在振荡过程中,每隔10min测定
pH,当pH低于9.0时,使用1mol/LNaOH调pH至9.5,每调整1次pH,延长振荡时间10min。
5.2.1.4 将提取液转移至50mL离心管,如体积较大,使用2支离心管。10000×g,4℃,离心30min。
取上清至无菌试管或三角瓶,用6mol/LHCl调pH至7.0。
5.2.1.5 向提取液中加入0.25倍提取液体积的5×PEG/NaCl溶液,使PEG/NaCl在提取液中的终含
量为100g/LPEG,0.3mol/LNaCl。室温,摇匀1min,然后,4℃,60次/min,振荡60min或4℃静置
过夜。10000×g,4℃,离心30min,弃上清。10000×g,4℃,离心5min紧实沉淀,弃上清。
5.2.1.6 加入500μLPBS重悬沉淀。如样品为生食蔬菜,直接将重悬液转移至无RNase离心管中,测
定并记录重悬液体积,用于后续RNA提取。如样品为软质水果,将重悬液转移至耐三氯甲烷的无菌离
心管中,加入500μL三氯甲烷/正丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5min,10000×g,4℃,离心
15min,将上清液转移至无RNase离心管中,测定并记录上清液体积,用于后续RNA提取。
5.2.2 硬质表面食品
5.2.2.1 将无菌棉拭子使用PBS湿润后,用力擦拭食品表面(如胡萝卜、瓜、坚果,50cm2≤擦拭面积≤
100cm2),记录擦拭面积。将10μL过程控制病毒添加至该棉拭子。如果食品表面过于粗糙,可能会损
坏棉拭子,可使用多个棉拭子,但只需在其中一个棉拭子上添加过程控制病毒。
5.2.2.2 将棉拭子浸入含490μLPBS试管中,紧贴试管一侧挤压出液体。如此重复浸入和挤压3次~
4次,确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体体积,用于后续RNA提取。
5.2.3 贝类
5.2.3.1 戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类样本。
5.2.3.2 使用无菌剪刀、无菌镊子或其他等效器具在橡胶垫上解剖贝类样本,取出贝类消化腺,置于无
菌培养皿中。收集2g贝类消化腺。
5.2.3.3 使用研钵或等效均质器将贝类消化腺匀浆后,转移至离心管。加入10μL过程控制病毒。加
入2.0mL蛋白酶K溶液,混匀。
5.2.3.4 使用全温振荡器或等效装置,37℃,320次/min,振荡60min。
5.2.3.5 将离心管放入水浴或等效装置,60℃,15min。随后,3000×g,室温,离心5min,将上清液转
移至无RNase离心管中,测定并记录上清液体积,用于后续RNA提取。
5.2.4 包装饮用水
5.2.4.1 取包装饮用水样品(≤1000mL),加入10μL过程控制病毒,振荡混匀。
5.2.4.2 向样品中加入一定质量的氯化镁(例如每升包装饮用水中加入4.76g氯化镁),充分溶解并混
匀,使 Mg2+终浓度为0.05mol/L。
5.2.4.3 用6mol/L盐酸调节水样pH至3.0。
5.2.4.4 用无菌镊子夹取混合纤维素膜(孔径0.45μm,直径47mm),置于过滤瓶上,进行抽滤,使所有
水样全部通过混合纤维素膜。
5.2.4.5 用无菌镊子取出混合纤维素膜,用无菌剪刀将滤膜剪碎,放入50mL离心管中,加入15mL
TGB E缓冲液,以400次/min,室温振荡30min。
5.2.4.6 将离心管中的提取液全部转移至另外一个无菌的50mL离心管中。
5.2.4.7 用6mol/L盐酸调节提取液的pH至7.0,并将提取液全部转移至超滤浓缩离心管中。
5.2.4.8 5000×g,室温,离心15min。随后,将浓缩管中的提取液转移至一个无RNase离心管中,测
定并记录提取液的体积,用于后续RNA提取。
5.3 病毒RNA提取和纯化
注:病毒RNA可手工提取和纯化,也可使用等效商品化病毒RNA提取试剂盒进行提取和纯化。病毒RNA提取
完成后,为延长RNA保存时间可选择性加入RNase抑制剂。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经
常更换。提取出来的RNA可立即进行检测,或在4℃下保存不超过8h,或在-80℃冰箱中保存不超过30d。
5.3.1 病毒裂解
将全部病毒提取液加入离心管,加入等体积的 Trizol试剂,混匀,剧烈涡旋振荡1min(大约
1800r/min),室温放置5min,加入0.2倍体积三氯甲烷,涡旋混匀30s(不能过于剧烈,以免产生乳化
层,也可用手颠倒混匀),12000×g,离心5min,上层水相移入新的无RNase离心管中,避免吸出中
间层。
5.3.2 病毒RNA提取
向离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5min,12000×g,室温,离心5min,弃上清,
倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品应用不同独立的吸水纸沾干),防止交叉污染。
5.3.3 病毒RNA纯化
5.3.3.1 加入1mL75%乙醇,颠倒洗涤RNA沉淀,12000×g,4℃,离心10min,小心弃上清。
5.3.3.2 重复加入1mL75%乙醇,颠倒洗涤RNA沉淀,12000×g,4℃,离心10min,小心弃上清,然
后将离心管倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品应用不同独立的吸水纸沾干),防止交叉污染。或用微
量移液器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰到沉淀物,室温干燥3min,不能过于干燥,以
免RNA不溶于水。
5.3.3.3 加入50μL无RNase超纯水,轻轻混匀,溶解沉淀至离心管底部的RNA,2000×g,室温,离心
5s,冰上保存备用。
5.4 质量控制
5.4.1 空白对照
以无RNase超纯水作为空白对照(A反应孔)。
5.4.2 阴性对照
以未检出诺如病毒的同种类食品样本,提取RNA,作为阴性对照(B反应孔)。
5.4.3 阳性对照
以外加扩增控制RNA,作为阳性对照(J反应孔)。
5.4.4 过程控制病毒
以样品中过程控制病毒的提取效率表示样品中诺如病毒的提取效率,作为病毒提取的过程控制。
5.4.4.1 将10μL过程控制病毒原液(约为1010PFU/mL)按5.3步骤提取病毒RNA,并纯化。
5.4.4.2 将提取和纯化的过程控制病毒RNA进行10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒
的引物和探针,采用附录B反应体系和参数,确定未稀释和梯度稀释的过程控制病毒RNA的Ct值。
5.4.4.3 以未稀释和梯度稀释的过程控制病毒RNA的浓度的lg值为X 轴,以对应的Ct值为Y 轴,绘
制标准曲线;要求标准曲线r2≥0.98。将未稀释的过程控制病毒RNA浓度设置为1,经过10倍梯度稀
释的过程控制病毒RNA浓度分别为10-1、10-2、10-3等。
5.4.4.4 将含过程控制病毒的食品样品RNA(C反应孔),加入过程控制病毒引物和探针,采用附录B
反应体系和参数,确定Ct值,代入标准曲线,计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒RNA浓度。
5.4.4.5 计算提取效率。提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒RNA浓度×100%,即(C反
应孔)Ct值对应浓度×100%。
5.4.5 外加扩增控制
通过外加扩增控制RNA,计算扩增抑制指数,作为扩增控制。
5.4.5.1 将外加扩增控制RNA(105copies/μL~106copies/μL)分别加入含过程控制病毒食品样品
RNA(H反应孔)、10倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA(I反应孔)、无RNase超纯水(J反应孔)
中,同时加入GⅠ或GⅡ基因组的引物和探针,采用附录B反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反
应,确定Ct值。
5.4.5.2 计算扩增抑制指数。扩增抑制指数=Ct值(含过程控制病毒食品样品RNA+外加扩增控制
RNA)-Ct值(无RNase超纯水+外加扩增控制RNA),即扩增抑制指数=Ct值(H反应孔)-Ct值
(J反应孔)。如抑制指数≥2.00,需比较经过10倍稀释的食品样品RNA的扩增抑制指数,即扩增抑制
指数=Ct值(I反应孔)-Ct值(J反应孔)。
5.5 实时荧光RT-PCR
实时荧光RT-PCR反应体系和反应参数详见附录B。反应体系中各试剂的加入量可根据具体情况
或不同的反应总体积进行适当调整。可采用商业化试剂盒,按照试剂盒的说明书进行操作。也可增加
或调整反应孔,实现1次反应完成诺如病毒GⅠ和GⅡ基因组的独立检测。首先配制荧光RT-PCR反
应的预混液,按照附录B中表B.1的顺序及加样量,依次将RT-PCR缓冲液、MgSO4、dNTPs、逆转录
酶、DNA聚合酶和无RNase超纯水进行混合,制备成荧光RT-PCR反应预混液。将反应预混液分别添
加至不同反应孔(15.88μL/孔),再向每个反应孔加入下述物质,分别检测GⅠ或GⅡ基因组的诺如病
毒以及过程控制病毒和计算扩增抑制指数。
A反应孔:空白对照,加入5.0μL无RNase超纯水+4.12μLGⅠ或GⅡ基因组的诺如病毒引物和
探针;
B反应孔:阴性对照,加入5.0μL阴性对照样品RNA+4.12μLGⅠ或GⅡ基因组的诺如病毒引物
和探针;
C反应孔:加入5.0μL含过程控制病毒食品样品RNA+4.12μL过程控制病毒引物和探针;
D反应孔:加入5.0μL过程控制病毒RNA+4.12μL过程控制病毒引物和探针;
E反应孔:加入5.0μL10倍稀释的过程控制病毒RNA+4.12μL过程控制病毒引物和探针;
F反应孔:加入5.0μL100倍稀释的过程控制病毒RNA+4.12μL过程控制病毒引物和探针;
G反应孔:加入5.0μL1000倍稀释的过程控制病毒RNA+4.12μL过程控制病毒引物和探针;
H反应孔:扩增控制1,加入5.0μL含过程控制病毒食品样品RNA+1.0μL外加扩增控制RNA+
4.12μLGⅠ或GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针;
I反应孔:扩增控制2,加入5.0μL10倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA+1.0μL外加扩增
控制 RNA+4.12μLGⅠ或GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针;
J反应孔:扩增控制3/阳性对照,加入5.0μL无RNase超纯水+1.0μL外加扩增控制RNA+4.12μL
GⅠ或 GⅡ基因组的诺如病毒引物和探针;
K反应孔:样品1,加入5.0μL含过程控制病毒食品样品RNA+4.12μLGⅠ或GⅡ基因组的诺如
病毒引物和探针;
L反应孔:样品2,加入5.0μL10倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA+4.12μLGⅠ或GⅡ基
因组的诺如病毒引物和探针。
6 结果与报告
6.1 检验有效性判定
6.1.1 需满足以下质量控制要求,检验结果方有效:空白对照阴性(A反应孔)、阴性对照阴性(B反应
孔)、阳性对照阳性(J反应孔)。
6.1.2 过程控制(C~G反应孔)需满足:过程控制病毒提取效率≥1%;如果提取效率< 1%,需重新检
测;如果提取效率< 1%,诺如病毒检测结果为阳性,判定为检测结果有效。
6.1.3 扩增控制(H~J反应孔)需满足:扩增抑制指数< 2.00;如果扩增抑制指数≥2.00,需比较10倍
稀释食品样品RNA的扩增抑制指数;如果10倍稀释食品样品RNA的扩增抑制指数< 2.00,则扩增有
效,且需采用10倍稀释食品样品RNA的Ct值作为检测结果;如果10倍稀释食品样品RNA的扩增抑
制指数≥2.00,扩增无效,需要重新检测;如果10倍稀释食品样品RNA的扩增抑制指数≥2.00,诺如病
毒检测结果为阳性,判定为检测结果有效。
6.2 结果判定
待测样品(K反应孔或L反应孔)Ct值≥45时,判定诺如病毒GⅠ或GⅡ基因组检测结果阴性;待
测样品(K反应孔或L反应孔)Ct值≤38时,判定诺如病毒GⅠ或GⅡ基因组检测结果阳性;待测样品
(K反应孔或L反应孔)Ct值38< Ct< 45时,应重复检测;重复检测结果Ct值≥45时,判定诺如病毒
GⅠ 或GⅡ基因组检测结果阴性;重复检测结果Ct值< 45时,判定诺如病毒GⅠ或GⅡ基因组检测结
果阳性。
样品平行处理的检测结果,只要其中一个结果为阳性,则判定该样品诺如病毒GⅠ或GⅡ基因组检
测结果阳性。
6.3 结果报告
7 其他
生物安全措施按GB 19489规定的要求严格执行。
附 录 A
实时荧光RT-PCR引物和探针
GⅠ和GⅡ基因组诺如病毒实时荧光RT-PCR引物和探针见表A.1。
表A.1 GⅠ和GⅡ基因组诺如病毒实时荧光RT-PCR引物和探针a
病毒名称 序列
扩增产物长度
bp
序列位置
诺如病毒
GⅠ基因组
QNIF4(上游引物):5'-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3';
TM9(探针):5'-FAM-TGGACAGGAGATCGC-MGB NFQ-3'b,c
位于 诺 如 病 毒
(GenBank登录
号 M87661.2)的
5291~5376
诺如病毒
GⅡ基因组
位于 诺 如 病 毒
(GenBank登录
号X86557.1)的
5012~5100
a 序列中N为(A,G,C,T),Y为(C,T),R为(A,G),W为(A,T)。
b 在对诺如病毒GⅠ进行单重检测时,可选择NVGG1p或TM9任何一条探针;在对诺如病毒GⅠ和GⅡ多重检
测时,选择TM9探针。
c 对诺如病毒进行多重检测时,TM9(探针)和QNIFs(探针)的5'端需要标记不同的荧光基团,例如:TM9(探针)
的5'端可以标记 HEX荧光基团,3'端标记 MGB NFQ淬灭基团;QNIFs(探针)的5'端标记FAM 荧光基团,
3'端标记BHQ1淬灭基团。
附 录 B
实时荧光RT-PCR的反应体系和参数
B.1 实时荧光RT-PCR反应体系见表B.1。
表B.1 实时荧光RT-PCR反应体系
名称 储存液浓度 终浓度
加样量/μL
GⅠa GⅡb 过程控制病毒c
RT-PCR缓冲溶液 5× 1× 5.00 5.00 5.00
MgSO4 25mmol/L 1mmol/L 1.00 1.00 1.00
dNTPs 10mmol/L 0.2mmol/L 0.50 0.50 0.50
上游引物 10μmol/L 0.5μmol/L 1.25 1.25 1.25
下游引物 10μmol/L 0.9μmol/L 2.25 2.25 2.25
逆转录酶 5U/μL 0.1U/μL 0.50 0.50 0.50
DNA聚合酶 5U/μL 0.1U/μL 0.50 0.50 0.50
探针 10μmol/L 0.25μmol/L 0.62 0.62 0.62
RNA模板 - - 5.00 5.00 5.00
水(无RNase) - - 8.38 8.38 8.38
总体积 - - 25.00 25.00 25.00
a 如果检测GⅠ,则上游引物为QNIF4,下游引物为NV1LCR,探针为NVGG1p或TM9。
b 如果检测GⅡ,则上游引物为QNIF2,下游引物为COG2R,探针为QNIFs。
c 如果检测过程控制病毒,则上游引物为 Mengo110或者 MS2-TM3F,下游引物为 Mengo209或者 MS2-TM3R,
探针为 Mengo147或者 MS2-TM2P。
B.2 实时荧光RT-PCR反应参数见表B.2。
表B.2 实时荧光RT-PCR反应参数
步骤 温度和时间 循环数
逆转录 55℃a,1h 1
预变性 95℃,5min 1
扩增
变性 95℃,15s
退火延伸
60℃,1min
65℃,1min,收集荧光信号
a 逆转录温度和时间应根据使用的逆转录酶最适反应条件决定。
附 录 C
过程控制病毒培养及引物和探针
C.1 门哥病毒
C.1.1 概要
本标准使用门哥病毒作为过程控制病毒进行过程控制,也可使用大肠埃希氏菌噬菌体 MS2或其他
等效、不与诺如病毒存在交叉反应的病毒。门哥病毒是小核糖核酸病毒科的鼠病毒。门哥病毒株 MC0
(ATCC VR-1597TM)是一种重组病毒,与野生型门哥病毒相比缺乏poly[C],是与野生型门哥病毒具
有相似生长特性的无毒表型。门哥病毒株 MC0 是一种转基因生物,如果实验室不允许使用转基因生
物,可以使用其他的过程控制病毒。也可以使用商业化试剂或试剂盒中的门哥病毒作为过程控制病毒。
C.1.2 试剂与耗材
C.1.2.1 HeLa细胞培养液
MEM)培养HeLa细胞,并将培养液中碳酸氢钠的终含量调整为1.5g/L,非必需氨基酸的终浓度调整
为0.1mmol/L,丙酮酸钠的终浓度调整为1.0mmol/L。向培养液中加入胎牛血清,使胎牛血清终含量
为100mL/L(胎牛血清/培养液)(细胞生长液)或20mL/L(胎牛血清/培养液)(细胞维持液)。
C.1.2.2 耗材
细胞培养所需耗材(例如细胞培养瓶)等。
C.1.3 仪器
二氧化碳(CO2)浓度可调节的恒温培养箱。
倒置显微镜。
C.1.4 培养过程
将门哥病毒加入铺满80%~90%的单层 HeLa(ATCCCCL-2TM)细胞的细胞培养瓶中,置于5%
浓度的二氧化碳恒温培养箱中,37℃进行培养,直至细胞培养瓶中有75%的 HeLa细胞出现细胞病变
效应。将细胞培养瓶经过一个冻融循环,然后取出培养液,3000×g离心10min,将上清液冻存于-80℃
冰箱,用于诺如病毒检验方法的过程控制。
C.1.5 引物和探针
门哥病毒实时荧光RT-PCR的引物和探针见表C.1。采用其他等效的过程控制病毒,需对应调整
引物和探针。
表C.1 门哥病毒实时荧光RT-PCR的引物和探针
病毒名称 序列
扩增产物长度
bp
序列位置
门哥病毒
Mengo110(上游引物):5'-GCGGGTCCTGCCGAAAGT-3'
100
位于 门 哥 病 毒
缺失毒株 MC0
的110~209,相
当于 门 哥 病 毒
非缺失毒株 M
(GenBank登录
号L22089.1)的
序列110~270
C.2 大肠埃希氏菌噬菌体 MS2
C.2.1 概要
本标准采用的大肠埃希氏菌噬菌体MS2属于单链RNA轻小噬菌体科,直径约26nm,正二十面体
结构,直径与肠道病毒相当。大肠埃希氏菌噬菌体 MS2对宿主具有高度的特异性,仅感染大肠埃希氏
菌,是RNA病毒检测理想的质控物质,成为理想的人类致病病毒替代物。如果实验室不能培养大肠埃
希氏菌噬菌体 MS2,也可以使用商业化试剂或试剂盒中的大肠埃希氏菌噬菌体 MS2作为过程控制
病毒。
C.2.2 试剂与耗材
C.2.2.1 菌株和大肠埃希氏菌噬菌体 MS2
大肠埃希氏菌噬菌体 MS2(ATCC15597-B1TM)及其宿主细菌E.coli(ATCC15597),或等效的大
肠埃希氏菌噬菌体 MS2和等效菌株。
C.2.2.2 试剂
细菌培养所需试剂(例如LB增菌液、TSA-YE培养基等)
C.2.2.3 耗材
细菌培养所需耗材(例如无菌培养皿)等。
C.2.3 仪器
恒温培养箱、全温振荡器。
C.2.4 培养过程
C.2.4.1 宿主菌的制备
用接种环挑取一环宿主菌E.coli(ATCC15597或等效菌株)接种在TSA-YE平板上,36℃±1℃
过夜培养;随后,挑取单个菌落至10mLLB增菌液中,36℃±1℃,培养过夜。
C.2.4.2 大肠埃希氏菌噬菌体 MS2制备
C.2.4.2.1 将C.2.4.1制备的含宿主菌的LB增菌液按照0.5%(体积分数)接种到新的LB增菌液中,
36℃±1℃,150次/min振荡培养4h~5h,然后,按0.5%~1%(体积分数)将噬菌体(108PFU/mL~
109PFU/mL)接种到上述含有宿主菌的增菌液中。
C.2.4.2.2 将接种噬菌体的宿主菌增菌液在36℃±1℃,150次/min振荡培养5h或静置过夜。按照
增菌液体积的2%加入三氯甲烷,200次/min振荡10min,随后,将增菌液10000×g离心10min,收集
上清液,用孔径为0.45μm的滤膜过滤,即得纯化的大肠埃希氏菌噬菌体 MS2,分装于5mL冻存管,
-80℃保存。
C.2.5 引物和探针
大肠埃希氏菌噬菌体 MS2实时荧光RT-PCR的引物和探针见表C.2。采用其他等效的过程控制
病毒,需对应调整引物和探针。
表C.2 大肠埃希氏菌噬菌体 MS2实时荧光RT-PCR引物和探针
病毒名称 序列
扩增产物长度
bp
序列位置
大肠埃希
氏菌噬菌
体 MS2
MS2-TM3F(上游引物):5'-GGCTGCTCGCGGATACCC-3'
MS2-TM3R(下游引物):5'-TGAGGGAATGTGGGAACCG-3'
202
位于大肠埃希
氏 菌 噬 菌 体
MS2 病 毒 株
(GenBank登录
号JF719743.1)
的序列3135-
3336
附 录 D
外加扩增控制RNA制备
D.1 概要
将目标DNA序列连接至合适的质粒载体上,确保目标序列位于质粒载体RNA聚合酶启动子序列
的下游。然后将含有目标序列的质粒线性化,再将线性化质粒加入体外RNA转录反应试剂中,从而制
备外加扩增控制RNA。GⅠ基因组外加扩增控制RNA的目标序列位于诺如病毒(GenBank登录号
M87661.2)的5291bp~5376bp之间。GⅡ基因组外加扩增控制RNA的目标序列位于诺如病毒
(GenBank登录号X86557.1)的5012bp~5100bp之间。
D.2 试剂与耗材
D.2.1 DNA连接酶及缓冲液:用于DNA连接及相关的缓冲液。
D.2.2 限制性内切酶及缓冲液:用于制备线性化质粒。
D.2.3 DNA纯化试剂。
D.2.4 体外RNA转录试剂(RNA聚合酶、dNTPs、缓冲液等)。
D.2.5 无RNase的DNase。
D.2.6 RNA纯化试剂。
D.2.7 DNA凝胶电泳相关试剂。
D.3 仪器
D.3.1 DNA凝胶电泳仪。
D.3.2 培养箱:37℃。
D.4 质粒DNA连接
合成诺如病毒GⅠ或者GⅡ的目标序列并进行纯化。将100ng~500ng经过纯化的目标DNA和
质粒载体加入含有合适的DNA连接酶及缓冲液的反应体系中,连接质粒和目标序列,并确保目标序列
位于质粒载体RNA聚合酶启动子序列的下游。37℃孵育120min。使用凝胶电泳检查DNA与质粒
的连接情况。
D.5 外加扩增控制RNA的制备
使用合适的限制性内切酶将质粒切开(酶切位点位于目标序列的下游),获得携带诺如病毒GⅠ或
者GⅡ目标序列的线性化质粒。将1μg经过纯化的线性化质粒DNA加入体外RNA转录反应试剂
中。37℃孵育120min。然后,向反应液中添加无RNase的DNase,并在37℃下孵育15min。使用
RNA纯化试剂盒纯化RNA,然后分装,-80℃储存,实验前取出备用。
注:逆转录温度应根据使用的逆转录酶的最适使用温度决定。可使用等效的商业化检测试剂盒中的外加扩增控制
RNA储备液,或请符合要求的合格供应商代为制备。
附 录 E
RNase的去除和无RNase溶液的配制
配制溶液用的酒精、异丙醇等应采用未开封的新品。配制溶液用的超纯水、玻璃容器、移液器吸头、
药匙等用具应无RNase。操作过程应始终佩戴一次性乳胶手套,并经常更换,以避免RNase污染用具
或带入溶液。
E.1 RNase的去除
E.1.1 玻璃容器应在240℃烘烤4h,去除RNase。
E.1.2 离心管、移液器吸头、药匙等耗材使用DEPC水(0.1%,体积分数)室温浸泡过夜,然后灭菌,烘
干;或直接购买无RNase的相应耗材。
E.2 无RNase溶液的配制
E.2.1 无RNase超纯水
E.2.1.1 成分
超纯水 100mL
焦碳酸二乙酯(DEPC) 100μL
E.2.1.2 制法
室温过夜,121℃,15min灭菌,或直接购买无RNase超纯水。
E.2.2 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGB E)缓冲液
E.2.2.1 成分
三(羟基甲基)氨基甲烷(C4H11NO3) 12.1g
甘氨酸(C2H5NO2) 3.8g
牛肉膏 10.0g
无RNase超纯水 定容至1000.0mL
E.2.2.2 制法
将固体物质溶解于900.0mL无RNase超纯水中,室温,调节pH至9.5。然后,用无RNase超纯水
定容至1000.0mL,高压灭菌。
E.2.3 5×PEG/NaCl溶液
E.2.3.1 成分
聚乙二醇(PEG)8000 500.0g
氯化钠(NaCl) 87.0g
无RNase超纯水 定容至1000.0mL
E.2.3.2 制法
将固体物质溶解于450.0mL无 RNase超纯水中,可缓慢加热,待固体物质完全溶解后,用无
RNase超纯水定容至1000.0mL,充分混匀,高压灭菌后备用。
E.2.4 磷酸盐缓冲液(PBS)
E.2.4.1 成分
氯化钠(NaCl) 8.00g
氯化钾(KCl) 0.20g
磷酸氢二钠(Na2HPO4) 1.15g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.20g
无RNase超纯水 定容至1000.0mL
E.2.4.2 制法
将固体物质溶解于900.0mL无RNase超纯水中,室温,调节pH至7.3,然后用无RNase超纯水定
容至1000.0mL,高压灭菌后备用。
E.2.5 三氯甲烷/正丁醇混合液
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