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| 标准编号 | GB 4789.8-2016 (GB4789.8-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验 | | 英文名称 | Microbiological examination of food hygiene -- Examination of Yersinia enterocolitica | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 11,165 | | 发布日期 | 2016-08-31 | | 实施日期 | 2017-03-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 4789.8-2008 | | 标准依据 | 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第11号 | GB 4789.8-2016
(Food safety national standard - Food microbiology - Examination of Yersinia enterocolitica)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验
小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
2016-08-31发布
2017-03-01实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
前言
本标准代替GB/T 4789.8-2008《食品卫生微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》。
本标准与GB/T 4789.8-2008相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验”;
---修改了典型菌落的形态描述;
---删除了生化鉴定中的商品化名称;
---描述了血清鉴定的方法。
食品安全国家标准
食品微生物学检验
小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
1 范围
本标准适用于食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 冰箱:0℃~4℃。
2.2 恒温培养箱:26℃±1℃、36℃±1℃。
2.3 显微镜:10倍~100倍。
2.4 均质器。
2.5 天平:感量0.1g。
2.6 灭菌试管:16mm×160mm、15mm×100mm。
2.7 灭菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。
2.8 锥形瓶:200mL、500mL。
2.9 灭菌平皿:直径90mm。
2.10 微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 改良磷酸盐缓冲液:见A.1。
3.3 改良Y培养基(AgarY,Modified):见A.3。
3.4 改良克氏双糖培养基:见A.4。
3.5 糖发酵管:见A.5。
3.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基:见A.6。
3.7 半固体琼脂:见A.7。
3.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]:见A.8。
3.9 碱处理液:见A.9。
3.10 尿素培养基:见A.10。
3.11 营养琼脂:见A.11。
3.12 小肠结肠炎耶尔森氏菌诊断血清。
4 检验程序
小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序见图1。
图1 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取25g(或25mL)样品放入含有225mL改良磷酸盐缓冲液增菌液的无菌均质杯或均
质袋内,以8000r/min均质1min或拍击式均质器均质1min。液体样品或粉末状样品,应振荡混匀。
均质后于26℃±1℃增菌48h~72h。增菌时间长短可根据对样品污染程度的估计来确定。
5.2 碱处理
除乳与乳制品外,其他食品的增菌液0.5mL与碱处理液4.5mL充分混合15s。
5.3 分离
将乳与乳制品增菌液或经过碱处理的其他食品增菌液分别接种于CIN-1琼脂平板和改良Y琼脂
平板,26℃±1℃培养48h±2h。典型菌落在CIN-1上为深红色中心,周围具有无色透明圈(红色牛
眼状菌落),菌落大小为1mm~2mm,在改良Y琼脂平板上为无色透明、不黏稠的菌落。
5.4 改良克氏双糖试验
分别挑取5.3中的可疑菌落3个~5个,分别接种于改良克氏双糖铁琼脂,接种时先在斜面划线,再
于底层穿刺,26℃±1℃培养24h,将斜面和底部皆变黄且不产气的培养物做进一步的生化鉴定。
5.5 尿素酶试验和动力观察
用接种环挑取一满环5.4得到的可疑培养物,接种到尿素培养基中,接种量应足够大,振摇几秒钟,
26℃±1℃培养2h~4h。将尿素酶试验阳性菌落分别接种于两管半固体培养基中,于26℃±1℃和
36℃±1℃培养24h。将在26℃有动力而36℃无动力的可疑菌培养物划线接种营养琼脂平板,进行
纯化培养,用纯化物进行革兰氏染色镜检和生化试验。
5.6 革兰氏染色镜检
将纯化的可疑菌进行革兰染色。小肠结肠炎耶尔森氏菌呈革兰氏阴性球杆菌,有时呈椭圆或杆状,
大小为(0.8μm~3.0μm)×0.8μm
5.7 生化鉴定
5.7.1 从5.5中的营养琼脂平板上挑取单个菌落接种生化反应管,生化反应在26℃±1℃进行。小肠
结肠炎耶尔森氏菌的主要生化特征以及与其他相似菌的区别见表1。
表1 小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别表
项 目
小肠结肠炎
耶尔森氏菌
Yersinia
中间型耶
尔森氏菌
Yersinia
intermedia
弗氏耶
尔森氏菌
Yersinia
frederiksenii
克氏耶
尔森氏菌
Yersinia
kirstensenii
假结核耶
尔森氏菌
Yersinia
鼠疫耶
尔森氏菌
Yersinia
pestis
动力(26℃) + + + + + -
尿素酶 + + + + + -
V-P试验(26℃) + + + - - -
鸟氨酸脱羧酶 + + + + - -
蔗糖 d + + - - -
棉子糖 - + - - - d
山梨醇 + + + + - -
甘露醇 + + + + + +
鼠李糖 - + + - - +
注:+阳性;-阴性;d有不同生化型。
5.7.2 如选择微生物生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统,可根据5.6镜检结果,选择革兰阴性球杆
菌菌落作为可疑菌落,从5.5所接种的营养琼脂平板上挑取单菌落,使用微生物生化鉴定试剂盒或微生
物生化鉴定系统进行鉴定。
5.8 血清型鉴定(选做项目)
除进行生化鉴定外,可选择做血清型鉴定。在洁净的载玻片上加一滴O因子血清,将待试培养物
混入其内,使成为均一性混浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5min~1min,在黑色背景下观察反应。如在
2min内出现比较明显的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以
检查有无自凝现象;具体操作方法可按GB 4789.4中沙门氏菌O因子血清分型方法进行。
6 结果与报告
综合以上及生化特征报告结果,报告25g(或25mL)样品中检出或未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 改良磷酸盐缓冲液
A.1.1 成分
磷酸氢二钠 8.23g
磷酸二氢钠 1.2g
氯化钠 5.0g
三号胆盐 1.5g
山梨醇 20.0g
A.1.2 制法
将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中,再加入三号胆盐及山梨醇,溶解后校正pH至7.6,分装试管,于
121℃高压灭菌15min,备用。
A.2 CIN-1培养基
A.2.1 基础培养基:
胰胨 20.0g
酵母浸膏 2.0g
甘露醇 20.0g
氯化钠 1.0g
去氧胆酸钠 2.0g
硫酸镁 0.01g
琼脂 12.0g
蒸馏水 950mL
校正pH至7.5±0.1,将基础培养基于121℃高压灭菌15min,备用。
A.2.2 Irgasan(二氯苯氧氯酚):可用95%的乙醇作溶剂,溶解二苯醚,配成0.4%的溶液来替代
Irgasan,待基础培养基冷至80℃时,加入1mL混匀。
A.2.3 冷至50℃时,加入:
中性红(3.0mg/mL) 10.0mL
结晶紫(0.1mg/mL) 10.0mL
头孢菌素(1.5mg/mL) 10.0mL
新生霉素(0.25mg/mL) 10.0mL
最后不断搅拌加入10.0mL的10%氯化锶,倾注平皿。
A.3 改良Y培养基
A.3.1 成分
蛋白胨 15.0g
氯化钠 5.0g
乳糖 10.0g
草酸钠 2.0g
去氧胆酸钠 6.0g
三号胆盐 5.0g
丙酮酸钠 2.0g
孟加拉红 40.0mg
水解酪蛋白 5.0g
琼脂 17.0g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
将A.3.1中成分混合,校正pH至7.4±0.1。于121℃高压灭菌15min,待冷至45℃左右时,倾注
平皿。
A.4 改良克氏双糖培养基
A.4.1 成分
蛋白胨 20.0g
牛肉膏 3.0g
酵母膏 3.0g
山梨醇 20.0g
葡萄糖 1.0g
氯化钠 5.0g
柠檬酸铁铵 0.5g
硫代硫酸钠 0.5g
琼脂 12.0g
酚红 0.025g
蒸馏水 1000mL
A.4.2 制法
将酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中,校正pH至7.4。加入0.2%的酚红溶液12.5mL,摇匀,分
装试管,装量宜多些,以便得到比较高的底层。121℃高压灭菌15min,放置高层斜面备用。
A.5 糖发酵管
A.5.1 成分
牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
氯化钠 3.0g
磷酸氢二钠 2.0g
0.2%溴麝香草酚蓝溶液 12.0mL
蒸馏水 1000mL
A.5.2 制法
A.5.2.1 葡萄糖发酵管按A.5.1中成分配好后,校正pH至7.4,按0.5%加入葡萄糖,分装于有一个倒
置小管的小试管内,121℃高压灭菌15min。
A.5.2.2 其他各种糖发酵管可按上述成分配好后,分装每瓶100mL,121℃高压灭菌15min。另将各
种糖类分别配好10%溶液,同时高压灭菌。将5mL糖溶液加入100mL培养基内,以无菌操作分装小
试管。蔗糖不纯,加热后会自行水解者,应采用过滤法除菌。
A.5.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取少量培养物接种于26℃±1℃培养,一般观察2d~3d。迟缓反应需观察
14d~30d。
A.6 鸟氨酸脱羧酶试验培养基
A.6.1 成分
蛋白胨 5.0g
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
蒸馏水 1000mL
1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液 1.0mL
L-鸟氨酸或DL-鸟氨酸 0.5g/100mL或1g/100mL
A.6.2 制法
除鸟氨酸以外的成分加热溶解后,分装,每瓶100mL,分别加入鸟氨酸。L-鸟氨酸按0.5%加入,
DL-鸟氨酸按1%加入。再校正pH 至6.8。对照培养基不加鸟氨酸。分装于无菌的小试管内,每管
0.5mL,上面滴加一层液体石蜡,115℃高压灭菌10min。
A.6.3 试验方法
从琼脂斜面上挑取培养物接种,于26℃±1℃培养18h~24h,观察结果。鸟氨酸脱羧酶阳性者
由于产碱,培养基呈紫色。阴性者无碱性产物,但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色。对照管为黄色。
A.7 半固体琼脂
A.7.1 成分
蛋白胨 1.0g
牛肉膏 0.3g
氯化钠 0.5g
琼脂 0.35g~0.4g
蒸馏水 100mL
A.7.2 制法
将A.7.1中成分配好,煮沸使溶解,并校正pH至7.4。分装小试管,121℃高压灭菌15min,直立
凝固备用。
注:供动力观察、菌种保存、H抗原位相变异试验等用。
A.8 缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红(MR)和V-P试验用]
A.8.1 成分
磷酸氢二钾 5.0g
多胨 7.0g
葡萄糖 5.0g
蒸馏水 1000mL
A.8.2 制法
溶化后校正pH至7.0,分装试管,每管1mL,121℃高压灭菌15min。
A.8.3 甲基红(MR)试验
自琼脂斜面挑取少量培养物接种本培养基中,于26℃±1℃培养2d~5d,哈夫尼亚菌则应在
22℃~25℃培养。滴加甲基红试剂一滴,立即观察结果。鲜红色为阳性,黄色为阴性。甲基红试剂配
法:10mg甲基红溶于30mL95%乙醇中,然后加入20mL蒸馏水。
A.8.4 V-P试验
用琼脂培养物接种本培养基中,于26℃±1℃培养2d~4d。哈夫尼亚菌则应在22℃~25℃培
养。加入6%α-萘酚-乙醇溶液0.5mL和40%氢氧化钾溶液0.2mL,充分振摇试管,观察结果。阳性反
应立刻或于数分钟内出现红色,如为阴性,应放在36℃±1℃培养4h再进行观察。
A.9 碱处理液
A.9.1 0.5%氯化钠溶液
氯化钠 0.5g
蒸馏水 100mL
121℃高压灭菌15min。
A.9.2 0.5%氢氧化钾溶液
氢氧化钾 0.5g
蒸馏水 100mL
121℃高压灭菌15min。
A.9.......
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