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| 标准编号 | GB 4789.9-2014 (GB4789.9-2014) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验 | | 英文名称 | Microbiological examination of food hygiene - Examination of Campylobacter jejuni | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 国际标准分类 | 07.100.30 | | 字数估计 | 15,175 | | 发布日期 | 2014/12/1 | | 实施日期 | 2015/5/1 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 4789.9-2008 | | 归口单位 | 国家卫生和计划生育委员会 | | 标准依据 | 国家卫生计生委公告2014年第19号 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 | | 范围 | 本标准规定了食品中空肠弯曲菌的检验方法。本标准适用于食品中空肠弯曲菌的检验。 | GB 4789.9-2014
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验
2014-12-01发布
2015-05-01实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
前言
本标准代替 GB/T 4789.9-2008《食品卫生微生物学检验 空肠弯曲菌检验》。
本标准与 GB/T 4789.9-2008相比,主要变化如下:
---修改了标准的中文名称;
---修改了范围;
---修改了设备和材料;
---修改了培养基和试剂;
---修改了样品处理;
---删除了药物敏感性试验;
---删除了第二法 全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验
1 范围
本标准适用于食品中空肠弯曲菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱:25℃±1℃、36℃±1℃、42℃±1℃;
b) 冰箱:2℃~5℃;
c) 恒温振荡培养箱:36℃±1℃、42℃±1℃;
d) 天平:感量0.1g;
e) 均质器与配套均质袋;
f) 振荡器;
g) 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头;
h) 无菌锥形瓶:容量100mL、200mL、2000mL;
i) 无菌培养皿:直径90mm;
j) pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸;
k) 水浴装置:36℃±1℃、100℃;
l) 微需氧培养装置:提供微需氧条件(5% 氧气、10% 二氧化碳和85% 氮气);
m) 过滤装置及滤膜(0.22μm、0.45μm);
n) 显微镜:10倍~100倍,有相差功能;
o) 离心机:离心速度≥20000g;
p) 比浊仪;
q) 微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 Bolton肉汤(Boltonbroth):见附录 A中 A.1。
3.3 哥伦比亚血琼脂(Columbiabloodagar):见附录 A中 A.3。
3.4 布氏肉汤(Brucelabroth):见附录 A中 A.4。
3.5 氧化酶试剂:见附录 A中 A.5。
3.6 马尿酸钠水解试剂:见附录 A中 A.6。
3.7 Skirrow血琼脂(Skirrowbloodagar):见附录 A中 A.7。
3.8 吲哚乙酸酯纸片:见附录 A中 A.8。
3.9 0.1%蛋白胨水:见附录 A中 A.9。
3.10 1mol/L硫代硫酸钠(Na2S2O3)溶液:见附录A中A.10。
3.11 3%过氧化氢(H2O2)溶液:见附录 A中 A.11。
3.12 空肠弯曲菌显色培养基。
3.13 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。
4 检验程序
空肠弯曲菌检验程序见图1。
图1 空肠弯曲菌检验程序
5 操作步骤
5.1 样品处理
5.1.1 一般样品
取25g(mL)样品(水果、蔬菜、水产品为50g)加入盛有225mLBolton肉汤的有滤网的均质袋
中(若为无滤网均质袋可使用无菌纱布过滤),用拍击式均质器均质1min~2min,经滤网或无菌纱布
过滤,将滤过液进行培养。
5.1.2 整禽等样品
用200mL0.1%的蛋白胨水充分冲洗样品的内外部,并振荡2min~3min,经无菌纱布过滤至
250mL离心管中,16000g离心15min后弃去上清液,用10mL0.1%蛋白胨水悬浮沉淀,吸取3mL
于100mLBolton肉汤中进行培养。
5.1.3 贝类
取至少12个带壳样品,除去外壳后将所有内容物放到均质袋中,用拍击式均质器均质1min~
2min,取25g样品至225mLBolton肉汤中(1∶10稀释),充分震荡后再转移25mL于225mL
Bolton肉汤中(1∶100稀释),将1∶10和1∶100稀释的Bolton肉汤同时进行培养。
5.1.4 蛋黄液或蛋浆
取25g(mL)样品于125mLBolton肉汤中并混匀(1∶6稀释),再转移25mL于100mLBolton
肉汤中并混匀(1∶30稀释),同时将1∶6和1∶30稀释的Bolton肉汤进行培养。
5.1.5 鲜乳、冰淇淋、奶酪等
若为液体乳制品取50g;若为固体乳制品取50g加入盛有50mL0.1%蛋白胨水的有滤网均质袋
中,用拍击式均质器均质15s~30s,保留滤过液。必要时调整pH至7.5±0.2,将液体乳制品或滤过
液以20000g离心30min后弃去上清,用10mLBolton肉汤悬浮沉淀(尽量避免带入油层),再转移
至90mLBolton肉汤进行培养。
5.1.6 需表面涂拭检测的样品
无菌棉签擦拭检测样品的表面(面积至少100cm2以上),将棉签头剪落到100mLBolton肉汤中
进行培养。
5.1.7 水样
将4L的水(对于氯处理的水,在过滤前每升水中加入5mL1mol/L硫代硫酸钠溶液)经0.45μm
滤膜过滤,把滤膜浸没在100mLBolton肉汤中进行培养。
5.2 预增菌与增菌
在微需氧条件下,36℃±1℃培养4h,如条件允许配以100r/min的速度进行振荡。必要时测定
增菌液的pH并调整至7.4±0.2,42℃±1℃继续培养24h~48h。
5.3 分离
将24h增菌液、48h增菌液及对应的1∶50稀释液分别划线接种于Skirrow 血琼脂与 mCCDA
琼脂平板上,微需氧条件下42℃±1℃培养24h~48h。另外可选择使用空肠弯曲菌显色平板作为
补充。
观察24h培养与48h培养的琼脂平板上的菌落形态,mCCDA 琼脂平板上的可疑菌落通常为淡
灰色,有金属光泽、潮湿、扁平,呈扩散生长的倾向。Skirrow 血琼脂平板上的第一型可疑菌落为灰色、
扁平、湿润有光泽,呈沿接种线向外扩散的倾向;第二型可疑菌落常呈分散凸起的单个菌落,边缘整齐、
发亮。空肠弯曲菌显色培养基上的可疑菌落按照说明进行判定。
5.4 鉴定
5.4.1 弯曲菌属的鉴定
5.4.1.1 概述
挑取5个(如少于5个则全部挑取)或更多的可疑菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板上,微需氧条件
下42℃±1℃培养24h~48h,按照5.4.1.1~5.4.1.5进行鉴定,结果符合表1的可疑菌落确定为弯曲
菌属。
表1 弯曲菌属的鉴定
项 目 弯曲菌属特性
形态观察
革兰氏阴性,菌体弯曲如小逗点状,两菌体的末端相接时呈S形、螺旋
状或海鸥展翅状a
动力观察 呈现螺旋状运动b
氧化酶试验 阳 性
微需氧条件下25℃±1℃生长试验 不生长
有氧条件下42℃±1℃生长试验 不生长
a 有些菌株的形态不典型。
b 有些菌株的运动不明显。
5.4.1.2 形态观察
挑取可疑菌落进行革兰氏染色,镜检。
5.4.1.3 动力观察
挑取可疑菌落用1mL布氏肉汤悬浮,用相差显微镜观察运动状态。
5.4.1.4 氧化酶试验
用铂/铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上,如果在10s内出现紫红色、紫
罗兰或深蓝色为阳性。
5.4.1.5 微需氧条件下25℃±1℃生长试验
挑取可疑菌落,接种到哥伦比亚血琼脂平板上,微需氧条件下25℃±1℃培养44h±4h,观察细
菌生长情况。
5.4.1.6 有氧条件下42℃±1℃生长试验
挑取可疑菌落,接种到哥伦比亚血琼脂平板上,有氧条件下42℃±1℃培养44h±4h,观察细菌
生长情况。
5.4.2 空肠弯曲菌的鉴定
5.4.2.1 过氧化氢酶试验
挑取菌落,加到干净玻片上的3%过氧化氢溶液中,如果在30s内出现气泡则判定结果为阳性。
5.4.2.2 马尿酸钠水解试验
挑取菌落,加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在36℃±1℃水浴中
温育2h或36℃±1℃培养箱中温育4h。沿着试管壁缓缓加入0.2mL茚三酮溶液,不要振荡,在
36℃±1℃ 的水浴或培养箱中再温育10min后判读结果。若出现深紫色则为阳性;若出现淡紫色或
没有颜色变化则为阴性。
5.4.2.3 吲哚乙酸酯水解试验
挑取菌落至吲哚乙酸酯纸片上,再滴加1滴灭菌水。如果吲哚乙酸酯水解,则在5min~10min内
出现深蓝色;若无颜色变化则表示没有发生水解。空肠弯曲菌的鉴定结果见表2。
表2 空肠弯曲菌的鉴定
特征
空肠弯曲菌
(C.jejuni)
结肠弯曲菌
(C.coli)
海鸥弯曲菌
(C.lari)
乌普萨拉弯曲菌
(C.upsaliensis)
过氧化氢酶试验 + + + -或微弱
马尿酸盐水解试验 + - - -
吲哚乙酸脂水解试验 + + - +
注:+表示阳性;-表示阴性。
5.4.2.4 替代试验
对于确定为弯曲菌属的菌落,可使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡代替5.4.2.1~5.4.2.3进行
鉴定。
5.5 结果报告
综合以上试验结果,报告检样单位中检出或未检出空肠弯曲菌。
附 录 A
培养基与试剂
A.1 Bolton肉汤 (Boltonbroth)
A.1.1 基础培养基
A.1.1.1 成分
动物组织酶解物 10.0g
乳白蛋白水解物 5.0g
酵母浸膏 5.0g
氯化钠 5.0g
丙酮酸钠 0.5g
偏亚硫酸氢钠 0.5g
碳酸钠 0.6g
α-酮戊二酸 1.0g
蒸馏水 1000.0mL
A.1.1.2 制法
将 A.1.1.1中各成分溶于蒸馏水中,121℃ 灭菌15min,备用。
A.1.2 无菌裂解脱纤维绵羊或马血
对无菌脱纤维绵羊或马血通过反复冻融进行裂解或使用皂角苷进行裂解。
A.1.3 抗生素溶液
A.1.3.1 成分
头孢哌酮 (cefoperazone) 0.02g
万古霉素(vancomycin) 0.02g
两性霉素B(amphotercinB) 0.01g
多粘菌素B(polymyxinB) 0.01g
乙醇/灭菌水 (50/50,体积分数) 5.0mL
A.1.3.2 制法
将 A.1.3.1中各成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。
A.1.4 完全培养基
A.1.4.1 成分
基础培养基 1000.0mL
无菌裂解脱纤维绵羊或马血 50.0mL
抗生素溶液 5.0mL
A.1.4.2 制法
当基础培养基的温度约为45℃左右时,无菌加入绵羊或马血和抗生素溶液,混匀,校正pH至7.4
±0.2(25℃),常温下放置不得超过4h,或在4℃左右避光保存不得超过7d。
A.2.1 基础培养基
A.2.1.1 成分
肉浸液 10.0g
动物组织酶解物 10.0g
氯化钠 5.0g
木炭 4.0g
酪蛋白酶解物 3.0g
去氧胆酸钠 1.0g
硫酸亚铁 0.25g
丙酮酸钠 0.25g
琼脂 8.0g~18.0g
蒸馏水 1000.0mL
A.2.1.2 制法
将 A.2.1.1中各成分溶于蒸馏水中,121℃ 灭菌15min,备用。
A.2.2 抗生素溶液
A.2.2.1 成分
头孢哌酮(cefoperazone) 0.032g
两性霉素B(amphotericinB) 0.01g
利福平(rifampicin) 0.01g
乙醇/灭菌水(50/50,体积分数) 5.0mL
A.2.2.2 制法
将 A.2.2.1中各成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。
A.2.3 完全培养基
A.2.3.1 成分
基础培养基 1000.0mL
抗生素溶液 5.0mL
A.2.3.2 制法
当基础培养基的温度约为45℃左右时,加入抗生素溶液,混匀。校正pH至7.4±0.2(25℃)。倾
注15mL于无菌平皿中,静置至培养基凝固。使用前需预先干燥平板。制备的平板未干燥时在室温放
置不得超过4h,或在4℃左右冷藏不得超过7d。
A.3 哥伦比亚血琼脂(Columbiabloodagar)
A.3.1.1 成分
动物组织酶解物 23.0g
淀粉 1.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 8.0g~18.0g
蒸馏水 1000.0mL
A.3.1.2 制法
将 A.3.1.1成分溶于蒸馏水中,121℃ 灭菌15min,备用。
A.3.2 无菌脱纤维绵羊血
无菌操作条件下,将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中,振摇约10min,静置后除去附有血纤维
的玻璃珠即可。
A.3.3 完全培养基
A.3.3.1 成分
基础培养基 1000.0mL
无菌脱纤维绵羊血 50.0mL
A.3.3.2 制法
当基础培养基的温度为45℃左右时,无菌加入绵羊血,混匀。校正pH 至7.3±0.2(25℃)。倾注
15mL完全培养基于无菌平皿中,静置至培养基凝固。制备的平板未干燥时在室温放置不得超过4h,
或在4℃左右冷藏不得超过7d。
A.4 布氏肉汤 (Brucelabroth)
A.4.1 成分
酪蛋白酶解物 10.0g
动物组织酶解物 10.0g
葡萄糖 1.0g
酵母浸膏 2.0g
氯化钠 5.0g
亚硫酸氢钠 0.1g
蒸馏水 1000.0mL
A.4.2 制法
将 A.4.1中各成分溶于蒸馏水中,校正pH 至7.0±0.2(25℃),121℃ 灭菌15min,备用。
A.5 氧化酶试剂
A.5.1 成分
四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g
蒸馏水 100.0mL
A.5.2 制法
使用前将 A.5.1中各成分溶于蒸馏水中。
A.6 马尿酸钠水解试剂
A.6.1 马尿酸钠溶液
A.6.1.1 成分
马尿酸钠 10.0g
磷酸盐缓冲液(PBS)组分:
氯化钠 8.5g
磷酸氢二钠 8.98g
磷酸二氢钠 2.71g
蒸馏水 1000.0mL
A.6.1.2 制法
将马尿酸钠溶于磷酸盐缓冲液中,过滤除菌。无菌分装,每管0.4mL,储存于-20℃。
A.6.2 3.5% (水合)茚三酮溶液 (质量/体积)
A.6.2.1 成分
(水合)茚三酮 (ninhydrin) 1.75g
丙酮 25.0mL
丁醇 25.0mL
A.6.2.2 制备
将(水合)茚三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。该溶液在避光冷藏时不超过7d。
A.7 Skirrow血琼脂 (Skirrowbloodagar)
A.7.1.1 成分
蛋白胨 15.0g
胰蛋白胨 2.5g
酵母浸膏 5.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000.0mL
A.7.1.2 制法
将 A.7.1.1中各成分溶于蒸馏水中,121℃ 灭菌15min,备用。
A.7.2 FBP溶液
A.7.2.1 成分
丙酮酸钠 0.25g
焦亚硫酸钠 0.25g
硫酸亚铁 0.25g
蒸馏水 100.0mL
A.7.2.2 制法
将 A.7.2.1中各成分溶于蒸馏水中,经0.22μm 滤膜过滤除菌。FBP根据需要量现用现配,在
-70℃储存不超过3个月或-20℃储存不超过1个月。
A.7.3 抗生素溶液
A.7.3.1 成分
头孢哌酮(cefoperazone) 0.032g
两性霉素B(amphotericinB) 0.01g
利福平(rifampicin) 0.01g
乙醇/灭菌水(50/50,体积分数) 5.0mL
A.7.3.2 制法
将 A.7.3.1中各成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。
A.7.4 无菌脱纤维绵羊血
无菌操作条件下,将绵羊血倒入盛有灭菌玻璃珠的容器中,振摇约10min,静置后除去附有血纤维
的玻璃珠即可。
A.7.5 完全培养基
A.7.5.1 成分
基础培养基 1000.0mL
FBP溶液 5.0mL
抗生素溶液 5.0mL
无菌脱纤维绵羊血 50.0mL
A.7.5.2 制法
当基础培养基的温度约为45℃左右时,加入FBP溶液、抗生素溶液与冻融的无菌脱纤维绵羊血,
混匀。校正pH至7.4±0.2(25......
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