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| 标准编号 | GB/T 14701-2019 (GB/T14701-2019) | | 中文名称 | 饲料中维生素B2的测定 | | 英文名称 | Determination of vitamin B2 in feeds | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B46 | | 国际标准分类 | 65.120 | | 字数估计 | 10,123 | | 发布日期 | 2019-06-04 | | 实施日期 | 2020-01-01 | | 起草单位 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心(北京)] | | 归口单位 | 全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76) | | 提出机构 | 全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76) | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 14701-2019: 饲料中维生素B2的测定
GB/T 14701-2019 英文名称: Determination of vitamin B2 in feeds
1 范围
本标准规定了饲料中维生素B2(即核黄素C17H20N10)测定的荧光分光光度法和高效液相色谱法。
本标准方法1适用于动物性和植物性饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中维生素B2 的测定,定量限为0.25mg/kg。
本标准方法2适用于维生素预混合饲料、复合预混合饲料、浓缩饲料中维生素B2 的测定,以荧光检测器检测时,定量限为5mg/kg;以紫外检测器检测时,定量限为10mg/kg。
浓缩饲料中维生素B2 的测定,方法1为仲裁法;维生素预混合饲料、添加剂预混合饲料中维生素
B2 的测定,方法2中的高效液相色谱荧光检测器方法为仲裁法。
2 规范性引用文件
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
3 方法1 荧光分光光度法
3.1 原理
维生素B2(核黄素)在440nm紫外光激发下产生绿色荧光,在一定浓度范围内其荧光强度与核黄
素含量成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质,由还原前后荧光强度之差与荧光强度的比值计算样品中维生素B2 的含量。
3.2 试剂或溶液
除非另有说明,所用试剂均为分析纯试剂,水为蒸馏水,符合GB/T 6682中三级用水或相当纯度
的水。
3.2.1 氢氧化钠溶液:0.05mol/L。
3.2.2 氢氧化钠溶液:1.0mol/L。
3.2.3 盐酸溶液:0.1mol/L。
3.2.4 盐酸溶液:1.0mol/L。
3.2.5 连二亚硫酸钠(Na2S2O4)。
3.2.6 高锰酸钾溶液:40g/L。
3.2.7 冰乙酸。
3.2.8 冰乙酸溶液,0.02mol/L:将1.8mL冰乙酸用水稀释至1000mL。
3.2.9 过氧化氢溶液,100mL/L,分析当天制备。
3.2.10 维生素B2 标准溶液
3.2.10.1 维生素B2 贮备液Ⅰ:称取在五氧化二磷干燥器里干燥24h的维生素B2 标准品(纯度大于
95%)25mg(精确至0.0001g)于250mL棕色锥形瓶中,加入约200mL冰乙酸溶液(3.2.8),在沸水浴
中煮沸直至溶解,冷却后转移至250mL棕色容量瓶中,用冰乙酸溶液(3.2.8)稀释至刻度。滴加甲苯覆盖,2℃~8℃冰箱保存,保存期6个月。该溶液含0.1mg/mL维生素B2。
3.2.10.2 维生素B2 贮备液Ⅱ:取维生素B2 贮备液Ⅰ(3.2.10.1)10mL用冰乙酸溶液(3.2.8)稀释至
100mL,置于棕色容量瓶中滴加甲苯覆盖,2℃~8℃冰箱保存,保存期3个月。该溶液中含10μg/mL
维生素B2。
3.2.10.3 维生素B2 标准工作液:取维生素B2 贮备液Ⅱ(3.2.10.2)10mL,用水稀释至100mL,分析前
制备。该溶液中含1μg/mL维生素B2。
3.2.11 荧光素标准溶液
3.2.11.1 荧光素贮备液:称取荧光素0.050g,用水稀释至1000mL,置于棕色瓶中2℃~8℃冰箱保
存。该溶液中含50μg/mL荧光素。
3.2.11.2 荧光素标准工作液:取1mL荧光素贮备液(3.2.11.1),用水定容至1000mL,置于棕色瓶中
2℃~8℃ 冰箱保存。该溶液中含0.05μg/mL荧光素。
3.2.12 溴甲酚绿pH指示剂
取溴甲酚绿0.1g,加氢氧化钠溶液(3.2.1)2.8mL溶解,再加水稀释至200mL。变色范围
pH3.6~5.2。
3.3 仪器设备
3.3.1 分析天平:感量0.0001g。
3.3.2 电热恒温水浴。
3.3.3 具塞玻璃刻度试管:15mL。
3.3.4 荧光分光光度计。
3.4 试样制备
按 GB/T 14699.1的规定,选取具有代表性的样品至少500g,用四分法缩减至100g;按
GB/T 20195的规定制备样品,磨碎,通过0.425mm孔筛,混匀,装入密闭容器中,避光低温保存备用。
3.5 试验步骤
以下操作应避免强光照射。
3.5.1 试样溶液的制备
称取饲料原料、配合饲料、浓缩饲料1g~2g(精确至0.001g)置于100mL棕色具塞锥形瓶中。加
入65mL盐酸溶液(3.2.3),于沸水浴中煮沸30min。在加热开始时,每隔5min~10min摇动锥形瓶
一次,以防试样结块。冷却至室温后,用氢氧化钠溶液(3.2.2)调节pH值至6.0~6.5,立即加盐酸溶液
(3.2.4)使pH值调至4.5(溴甲酚绿指示剂变为草绿色)。转移至100mL棕色容量瓶中,用水稀释至刻
度。通过中速无灰滤纸过滤,弃去最初5mL~10mL溶液,收集滤液于100mL棕色锥形瓶中。取整
份清液,滴加稀盐酸检查蛋白质,如有沉淀生成,继续加氢氧化钠溶液,剧烈振摇使之沉淀完全。再次过滤作为待测试液。
3.5.2 杂质氧化
于a、b、c三支15mL刻度试管(3.3.3)中各吸入试样溶液(3.5.1)10mL,同时做平行,向试管a中加
入水1mL,向试管b中加入维生素B2 标准工作液(3.2.10.3)1mL。然后各加入冰乙酸(3.2.7)1mL,
旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液(3.2.6)0.5mL,旋摇混匀,静置2min,再逐个加入过氧化氢溶液
(3.2.9)0.5mL旋摇,使高锰酸钾颜色在10s内消退。加盖摇动,使气泡逸出。
3.5.3 测定
用荧光素标准工作液(3.2.11.2)调整荧光仪,使其稳定于一定数值,作为仪器工作的固定条件。调
整激发波长440nm,发射波长525nm,测定试管a、试管b的荧光强度,试样溶液在仪器中受激发照射
不超过10s;在试管c中加入20mg连二亚硫酸钠(3.2.5),摇动溶解,并使试管中的气体逸出,迅速测定
其荧光强度作为荧光空白。若溶液出现浑浊,不能读数。
3.6 试验数据处理
试样中维生素B2 的含量wi 以质量分数表示,单位为毫克每千克(mg/kg),按式(1)计算:
3.7 精密度
对于维生素B2 含量低于5mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测定结果与其算术平
均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的15%;
对于维生素B2 含量大于5mg/kg而小于50mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测
定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%;
对于维生素B2 含量大于50mg/kg的饲料,在重复性条件下,获得的两次独立测定结果与其算术
平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。
4 方法2:高效液相色谱法
4.1 原理
试样中核黄素经酸性溶液超声提取后,经离心、过滤后的试样溶液注入高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离,用紫外检测器(二极管矩阵检测器)或荧光检测器检测,外标法计算维生素B2 的含量。
4.2 试剂或溶液
除特殊说明外,所用试剂均为分析纯,水为蒸馏水,色谱用水为去离子水,符合GB/T 6682中一级
用水规定。
4.2.1 二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA):优级纯。
4.2.2 庚烷磺酸钠(PICB7):优级纯。
4.2.3 磷酸二氢钠:优级纯。
4.2.4 冰乙酸:优级纯。
4.2.5 三乙胺:色谱纯。
4.2.6 甲醇:色谱纯。
4.2.7 提取液:在1000mL容量瓶中,称50mg(精确至0.001g)EDTA(4.2.1),加入约700mL去离子
水,超声使EDTA完全溶解。加入25mL冰乙酸(4.2.4)、5mL三乙胺(4.2.5),用去离子水定容至刻度
摇匀。
4.2.8 磷酸二氢钠溶液:称取3.9g磷酸二氢钠,溶于1000mL去离子水,过膜备用。
4.2.9 流动相Ⅰ:在1000mL容量瓶中,称入50mg(精确至0.001g)EDTA(4.2.1)、1.1g(精确至
0.001g)庚烷磺酸钠(4.2.2),加入约700mL去离子水,超声使固体全部溶解。加入25mL冰乙酸
(4.2.4)、5mL三乙胺(4.2.5),用去离子水定容至刻度摇匀。用冰乙酸、三乙胺调节该溶液pH 至
3.70±0.10,过0.45μm滤膜。取该溶液800mL与200mL甲醇(4.2.6)混合,超声脱气,备用。
4.2.10 维生素B2 标准溶液
4.2.10.1 维生素B2 标准贮备液:称取在五氧化二磷干燥器里干燥24h的维生素B2(纯度大于95%)
10mg(精确至0.0001g)于250mL锥形瓶中,加1mL冰乙酸(4.2.4)在沸水浴煮沸30min,待固体颗
粒完全溶解,取出冷却至室温后转移入250mL棕色容量瓶中,用去离子水定容至刻度。此溶液中维生素B2 浓度为50μg/mL,置于冰箱2℃~8℃保存,可使用6个月。
4.2.10.2 维生素B2 标准工作液:测定维生素预混合饲料样品,可直接使用维生素B2 标准贮备液
(4.2.10.1)中的标准溶液作为上机标准溶液;测定复合预混合饲料、浓缩饲料样品,应准确吸取5mL维生素B2 标准贮备液(4.2.10.1)于50mL棕色容量瓶中,用提取液定容至刻度。该标准工作液中维生素B2 浓度为5μg/mL,分析前稀释备用。
4.3 仪器设备
4.3.1 高效液相色谱仪:带紫外检测器(二极管矩阵检测器)或荧光检测器。
4.3.2 pH计:带温控,精度0.01。
4.3.3 恒温水浴锅:0℃~100℃。
4.3.4 针头过滤器:备0.45μm水系滤膜。
4.4 试样的制备
按GB/T 14699.1的规定采样,选取有代表性的饲料样品至少500g,四分法缩减至100g;按
GB/T 20195的规定制备样品,磨碎,全部通过0.425mm孔筛,混匀,装入密闭容器中,避光低温保存
备用。
4.5 试验步骤
以下操作应避免强光照射。
4.5.1 试样溶液的制备
称取维生素预混合饲料试样0.25g~0.50g(精确至0.0001g)或复合预混合饲料、浓缩饲料2g~3g
(精确至0.001g),于100mL棕色锥形瓶中,加入约70mL的提取液(4.2.7)于100℃水浴中煮沸
30min~40min,最初的几分钟里,摇动锥形瓶以防止固体结块。待冷却后,转移至100mL棕色容量
瓶中,用提取液定容至刻度,混匀、过滤。对于维生素预混合饲料,需要使用提取液进一步稀释5~10倍。
上液相色谱仪测定前所有试液均需经0.45μm滤膜(4.3.4)过滤。
4.5.2 测定
4.5.2.1 高效液相色谱参考条件Ⅰ
色谱柱:C18,长250mm,内径4.6mm,粒度5μm,或性能相当的C18柱......
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