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标准编号 | GB/T 16886.5-2017 (GB/T16886.5-2017) | 中文名称 | 医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性试验 | 英文名称 | Biological evaluation of medical devices -- Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity | 行业 | 国家标准 (推荐) | 中标分类 | C30 | 国际标准分类 | 11.100.20 | 字数估计 | 34,312 | 发布日期 | 2017-12-29 | 实施日期 | 2018-07-01 | 起草单位 | 国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心、国家食品药品监督管理总局北京医疗器械质量监督检验中心、江苏省医疗器械检验所、上海生物材料研究测试中心 | 归口单位 | 全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC/TC 248) | 提出机构 | 国家食品药品监督管理总局 | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 |
GB/T 16886.5-2017
Biological evaluation of medical devices--Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity
ICS 11.100.20
C30
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 16886.5-2003
医疗器械生物学评价
第5部分:体外细胞毒性试验
(ISO 10993-5:2009,IDT)
2017-12-29发布
2018-07-01实施
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会发布
目次
前言 Ⅲ
引言 Ⅴ
1 范围 1
2 规范性引用文件 1
3 术语和定义 1
4 样品和对照品制备 2
5 细胞系 4
6 培养基 4
7 贮存培养细胞制备 4
8 试验步骤 5
9 试验报告 8
10 结果评定 8
附录A(资料性附录) 中性红摄取(NRU)细胞毒性试验性 9
附录B(资料性附录) 集落形成细胞毒性试验 15
附录C(资料性附录) MTT细胞毒性试验 19
附录D(资料性附录) XTT细胞毒性试验 23
参考文献 27
前言
GB/T 16886《医疗器械生物学评价》,由下列部分组成:
---第1部分:风险管理过程中的评价与试验;
---第2部分:动物福利要求;
---第3部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验;
---第4部分:与血液相互作用试验选择;
---第5部分:体外细胞毒性试验;
---第6部分:植入后局部反应试验;
---第7部分:环氧乙烷灭菌残留量;
---第9部分:潜在降解产物的定性与定量框架;
---第10部分:刺激与迟发型超敏反应试验;
---第11部分:全身毒性试验;
---第12部分:样品制备与参照材料;
---第13部分:聚合物降解产物的定性与定量;
---第14部分:陶瓷降解产物的定性与定量;
---第15部分:金属与合金降解产物的定性与定量;
---第16部分:降解产物与可沥滤物毒代动力学研究设计;
---第17部分:可沥滤物允许限量的建立;
---第18部分:材料化学表征;
---第19部分:材料物理化学、形态学和表面特性表征;
---第20部分:医疗器械免疫毒理学试验原则和方法。
本部分为GB/T 16886的第5部分。
本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本部分代替GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性试验》,与
GB/T 16886.5-2003相比,主要技术变化如下:
---修改了“材料浸提液的制备”“试验步骤”“结果评价”等相关内容,给出了细胞毒性定性和定量
评价指标(见4.2、第8章和第10章,2003版的4.2、第8章和第10章);
---增加了性红摄取(NRU)细胞毒性试验(见附录A);
---增加了集落形成细胞毒性试验(见附录B);
---增加了 MTT细胞毒性试验(见附录C);
---增加了XTT细胞毒性试验(见附录D)。
本部分使用翻译法等同采用ISO 10993-5:2009《医疗器械生物学评价 第5部分:体外细胞毒性
试验》。
与本部分中规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下:
GB/T 16886.1-2011 医疗器械生物学评价 第1部分:风险管理过程中的评价与试验
(ISO 10993-1:2009,IDT)
GB/T 16886.12-2017 医疗器械生物学评价 第12部分:样品制备与参照材料(ISO 10993-12:
2012,IDT)
本部分由国家食品药品监督管理总局提出。
本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC/TC248)归口。
本部分起草单位:国家食品药品监督管理局济南医疗器械质量监督检验中心、国家食品药品监督管
理总局北京医疗器械质量监督检验中心、江苏省医疗器械检验所、上海生物材料研究测试中心。
本部分主要起草人:侯丽、孙晓霞、王蕊、贺学英、高静贤、王莎莎、孙皎、黄晢玮。
本部分所代替标准的历次版本发布情况为:
---GB/T 16886.5-1997;
---GB/T 16886.5-2003。
引 言
体外细胞毒性试验具有通用性,广泛适用于各种医疗器械和材料的评价。因此,GB/T 16886的本
部分的目的不是规定一个单一的试验方法,而是规定一个试验方案,需要在一系列试验步骤中判断,以
选出最合适的试验。
试验分成三类:浸提液试验、直接接触试验、间接接触试验。
根据被评价样品的性质、使用部位和使用特性选择这些试验中的一类或几类。
试验的选择决定了供试样品的制备方法、培养细胞的制备以及细胞与样品或其浸提液接触的方式。
接触试验结束时,对细胞毒性作用和毒性程度进行评价。GB/T 16886的本部分放开了对评价方
式的选择,这一策略使得可以一系列试验可供选用,反映了许多提倡体外生物学试验团体的观点。
细胞毒性测定中所使用的大量方法和终点测定方法可分成以下评价类型:
---按形态学方法评定细胞损伤;
---细胞损伤的测定;
---细胞生长的测定;
---细胞代谢特性的测定。
在这四种类型中,每一类都有几种可供选择的方法,研究者宜了解试验的分类及其相应的专项技
术,以便可以与类似器械或材料的其他结果在实验室内部和各实验室间的水平上具有可比性。附录中
给出了定量试验方法举例。GB/T 16886的本部分还给出了试验结果的解释指南。
医疗器械生物学评价
第5部分:体外细胞毒性试验
1 范围
GB/T 16886的本部分描述了评定医疗器械体外细胞毒性的试验方法。
本部分规定了与器械和/或器械浸提液直接接触或通过扩散的方式与培养细胞接触的孵育方法。
本部分适用于适宜的生物学参数体外测定哺乳动物细胞的生物学反应。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
ISO 10993-1 医疗器械生物学评价 第1部分:风险管理过程中的评价与试验(Biologicalevalua-
3 术语和定义
ISO 10993-1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1
培养器皿 culturevessels
适用于细胞培养的器皿,包括玻璃培养皿、塑料培养瓶或塑料多孔培养板和微量滴定板等器皿。
注:在这些试验方法中,这些器皿只要符合组织培养级别的要求,并适用于哺乳动物细胞培养,可以互换使用。
3.2
按照本部分试验时可再现细胞毒性反应的材料。
注:阳性对照的目的是显示适用试验系统的反应,例如用有机锡作稳定剂的聚氨酯1)已用作固体材料和浸提液的阳
性对照,苯酚的稀释液用于浸提液的阳性对照。除了一种材料外还可采用纯化学物来证明试验系统的性能。
1) 含二乙基二硫代氨基甲酸锌(ZDEC)和二乙基二硫代氨基甲酸盐(ZDBC)的聚氨酯可从 Hatano研究所食品药
品安全中心(Ochiai729-5,Hadanoshi,Kanagawa257,Japan)获取。给出的信息是为了便利本部分的使用者,不
代表标准发布者认可这些产品,相等的产品如能够产生相同的结果也可以使用。
3.3
空白 blank
不含试验样品的浸提介质,浸提期间置于与试验样品相同的器皿中,并经受与试验样品相同的
条件。
注:空白的目的是为了评价浸提器皿、浸提介质和浸提过程可能的干扰作用。
3.4
按照本部分试验时不产生细胞毒性反应的材料。
注:阴性对照的目的是显示细胞的背景反应,例如高密度聚乙烯2)以作为合成聚合物的阴性对照,氧化铝陶瓷棒则
用作牙科材料的阴性对照。
2) 高密度聚乙烯可从美国药典委员会(Rockvile,MD,USA)和 Hatano研究所食品和药品安全中心(Ochiai729-
5,Hadanoshi,Kanagawa257,Japan)获取。给出的信息是为了便利本部分的使用者,不代表标准发布者认可这
些产品,相等的产品如能够产生相同的结果也可以使用。
3.5
试验样品 testsample
用于生物学试验、化学试验或评价的材料、器械、器械的一部分、组件、浸提液或其中一部分。
3.6
近汇合 subconfluency
在对数生长期末,约80%的细胞汇合。
4 样品和对照品制备
4.1 总则
试验应选用:
a) 试验样品浸提液;和/或
b) 试验样品自身。
样品制备应符合ISO 10993-12。
每一试验应包括阴性对照和阳性对照。
4.2 材料浸提液的制备
4.2.1 浸提原则
为了测定潜在的毒理学危害,除非在临床应用过程中需要,浸提条件宜模拟或严于临床使用条件,
但不导致试验材料发生诸如熔化、溶解或化学结构任何改变等明显变化。因为某些材料的特性(如生物
可降解材料),在浸提过程中可能会发生化学结构的改变。
注:浸提液中任何内源性或外源性物质的浓度及其接触试验细胞的量取决于界面面积、浸提体积、pH、化学溶解
度、扩散率、渗透压、搅拌、温度、时间和其他因素。
对于患者在使用中混合两种或多种组分而成为最终产品的器械(如骨水泥),该器械在浸提前不宜
清洗。清洗该试验样品可能会减少或去除该器械上的残留物。如果该试验样品在无菌环境中使用,宜
采用已灭菌的试验样品浸提化学组分。
4.2.2 浸提介质
根据试验样品的化学特性选择浸提介质,应进行论证并形成文件。哺乳动物细胞试验中应使用下
列一种或几种介质:
a) 含血清培养基;
b) 生理盐水溶液;
c) 其他适宜的介质。
介质的选择宜反映出浸提的目的,应考虑使用极性和非极性两种介质。含血清培养基是首选的浸
提介质,优先选用含血清培养基用于浸提是由于其具有支持细胞生长以及浸提极性和非极性两种物质
的能力。除了含血清培养基,在明确要浸提极性物质(例如离子化合物)时宜考虑采用无血清培养基。
其他适宜的介质包括纯水和二甲基亚砜(DMSO)。在所选择的测试系统中,DMSO如高于0.5%(体积
分数)时有细胞毒性。与含血清培养基浸提法相比,由于DMSO浸提液稀释度较大,可浸提物的细胞接
触浓度会比较低。
注1:试验可能会采用不同类型的血清(例如胎牛血清、牛/小牛血清、新生小牛血清),血清的选择根据细胞类型
而定。
注2:考虑到血清/蛋白质已知在某种程度上会同溶出物进行结合是很重要的。
4.2.3 浸提条件
4.2.3.1 浸提应采用无菌技术,在无菌、化学惰性的封闭容器中进行,应符合ISO 10993-12。
4.2.3.2 应按照下列一种条件并应按照器械特性和具体使用情况进行浸提,除了之后给出的情况外:
a) (37±1)℃、(24±2)h;
b) (50±2)℃、(72±2)h;
c) (70±2)℃、(24±2)h;
d) (121±2)℃、(1±0.2)h。
上述浸提条件是基于历史资料,已用于提供器械或材料风险评估中潜在危害的测定。可采用其他
条件(例如在37℃时延长或缩短浸提时间),模拟临床使用中的浸提或提供潜在危害的一种适当的测
定,但应进行论证并形成文件。对短期(累积接触时间不大于4h)与未受损皮肤或黏膜接触并且是非
植入的器械,在a)~c)所给条件下,浸提时间可小于24h但不小于4h。
含血清培养基只能按照a)规定的浸提条件,因为浸提温度超过(37±1)℃会对血清化学和/或血清
稳定性以及培养基中其他成分产生不良影响。
对聚合物试验样品,由于高温会改变浸提物成分,浸提温度不宜超过材料玻璃化温度。
4.2.3.3 浸提液接触细胞之前,如果进行过滤、离心或用其他方法处置,最终报告(见第9章)中对此应
详细记录并对这些步骤加以说明,任何对浸提液pH的调整也应在报告中说明。宜避免对浸提液进行
处理,例如对pH的调整,因为这会影响到试验结果。
4.3 直接接触试验材料的制备
4.3.1 试验样品形态
在细胞毒性检测中,各种形状、尺寸或物理状态(如液体、凝胶、固体等)的材料未经修整即可进行
测试。
固体材料首选试验样品宜至少有一个平面,如无平面则应修整出平面。
4.3.2 试验样品的无菌性
4.3.2.1 应考虑试验样品的无菌性。
4.3.2.2 取自灭菌器械试验样品的试验全过程应按无菌操作法进行。
4.3.2.3 试验样品如取自通常非无菌供应但在使用前灭菌的器械,应按照制造商推荐的方法灭菌,并且
试验全过程应按无菌操作法进行。
用于试验系统之前,规定试验样品制备方法时宜考虑灭菌方法或灭菌剂对器械的影响。
4.3.2.4 试验样品如取自使用中不需要灭菌的器械,则应在供应状态下使用,在试验全过程中应按无菌
操作法进行。为了避免细胞培养的微生物污染,对试验材料进行灭菌或许是合理的,但是灭菌过程不应
改变试验材料的性能。
如使用非灭菌试验样品,宜检查细菌污染情况,因为这可能会导致虚假的细胞毒性评定。
4.3.3 液体试验样品
对液体试验样品进行试验应:
a) 直接放置;或
b) 放置到生物惰性吸水性的基质上。
滤膜是已发现的适用的惰性吸水性基质。
4.3.4 吸水性试验样品
对吸水性试验样品,如果适宜,试验前应用培养基将其浸透,以防止其吸收试验器皿中的培养基。
4.4 对照品制备
宜选择对照品,可采用与试验样品相同的步骤制备。
5 细胞系
优先采用已建立的细胞系并应从认可的贮源获取3)。
3) 例如,ISO 专家认同的适宜的细胞系有美国菌种保藏中心CCL1(NCTCclone929)、CCL163(Balb/3T3clone
A31)、CCL171(MRC-5)和CCL75(WI-38)、CCL81(Vero)和CCL10[BHK-21(C-13)]和V-79379A。给出该
信息是为了便利本部分的使用者,不代表ISO 认可这些产品。其他细胞系如能产生相同的或更具相关性的结
果也可使用。
在需要特殊敏感性时,如能证明其反应的再现性和准确度,应只能使用直接从活体组织获取的原代
培养细胞、细胞系和器官型培养物。
若冻存某一贮存培养细胞系时,则应将其放在相应培养基内,在-80℃或-80℃以下冻存,培养
基内加有低温防护剂,如二甲基亚砜或甘油。长期贮存(数月至数年)只能在-130℃或-130℃以下
冻存。
试验应只能使用无支原体污染细胞,使用前宜检测原代培养细胞是否存在支原体。
定期检查细胞(如形态、倍增时间、有代表性的染色体数目)是重要的,因为试验敏感性会随着传代
次数而发生改变。
宜采用良好细胞培养操作规程,见参考文献[5]。
6 培养基
培养基应无菌。
含血清或无血清培养基应符合选定细胞系的生长要求。
培养基中可含有对试验无不良作用的抗生素。
贮存条件应进行确认。
注:培养基的稳定性与其成分和贮存条件有关。
培养基的pH应保持在7.2~7.4。
7 贮存培养细胞制备
用选定的细胞系和培养基制备试验所需足够的细胞。使用存储的培养细胞时,如加有低温防护剂
要除去,使用前至少传代培养一次。
传代培养细胞时,采用适合细胞系的酶分散法和/或机械分散法移出和重悬细胞。
8 试验步骤
8.1 平行样数
应至少采用三个平行试验样品数和对照品数。
8.2 浸提液试验
8.2.1 本试验用于细胞毒性定性和定量评定。
8.2.2 从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液,注入与浸提液接触的足够数量的各器皿内,轻
轻转动器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。
8.2.3 根据培养基选择适宜的缓冲系统,在含或不含二氧化碳的空气中,(37±1)℃进行培养。
试验宜在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。
在集落形成试验中,应只能采用适宜低密度细胞。
8.2.4 试验开始前用显微镜验证培养细胞的近汇合和形态学情况。特殊情况下,在试验起始点可接种
指数生长细胞(如原代细胞、高增殖细胞)。
8.2.5 试验可选用:
a) 浸提原液;和/或
b) 浸提原液和以浸提介质作稀释剂的浸提液的系列稀释液。
或者,已知或怀疑材料的溶解度受限时,宜通过改变试验样品与浸提介质的原始浸提比例达到
稀释。
试验如采用单层细胞,应弃去培养器皿中的培养基,在每个器皿内加入等量浸提液或其稀释液。
试验如采用悬浮细胞,细胞悬浮液制备好后立即将浸提液或其稀释液加到每只平行器皿中。
8.2.6 采用水等非生理浸提液时,浸提液用培养基稀释后应在最高生理相容浓度下进行试验。
注:推荐使用浓缩的(如2倍、5倍)培养基稀释水性浸提液。
8.2.7 加入已知等量的空白和阴性及阳性对照液至其他平行器皿中。
注:适宜时,还可用新鲜培养基做对照试验。
8.2.8 器皿按8.2.3中所述同样条件进行培养,适当的培养周期与选定的具体方法相一致。
8.2.9 经过至少24h的培养后,按8.5确定细胞毒性反应。
8.3 直接接触试验
8.3.1 本试验用于细胞毒性定性和定量评价。
8.3.2 从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取已知等量的悬浮液,注入与试验样品直接接触的足够数量的各
器皿内。轻轻水平转动器皿,使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.3.3 根据培养基所选的缓冲系统,在含或不含二氧化碳的空气中,(37±1)℃进行培养,直至培养细
胞生长至近汇合。
8.3.4 试验开始前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态学情况。特殊情况下,在试验起始点可接种
指数生长细胞(如原代细胞、高增殖细胞)。
8.3.5 弃去培养器皿中的培养基,加入新鲜培养基至各器皿内。
8.3.6 在每只器皿中央部位的细胞层上小心地各放置一个试验样品的试样,确保试样覆盖细胞层表面
约十分之一。
如经证实也可采用其他试样表面与细胞层表面比率。
操作时应注意防止试样不必要的移动,否则可能会导致细胞的物理性损伤,如不必要的移动可造成
脱落细胞的碎片。
注:适宜时,在细胞加入前将试样放入培养器皿内。
8.3.7 同法制备阴性对照和阳性对照材料器皿。
8.3.8 器皿按8.3.3中所述同样条件进行培养,适当的培养周期(最少24h)与选定的具体方法相一致。
8.3.9 在加入化学物/染料之前除去上层培养基,按8.5确定细胞毒性反应。
8.4 间接接触试验
8.4.1 琼脂扩散试验
8.4.1.1 本试验用于细胞毒性定性评定,本法不适用于不能通过琼脂层扩散或可能与琼脂相互作用的
可沥滤物。使用琼脂扩散试验进行细胞毒性评定应进行论证。
8.4.1.2 从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取已知等量的悬浮液,注入足够数量的试验用各平行器皿内。
轻轻水平转动器皿,使细胞均匀地分散在每只器皿的表面。
8.4.1.3 根据培养基所选的缓冲系统,在含或不含二氧化碳的空气中,(37±1)℃进行培养,直至生长曲
线的对数生长期末细胞近汇合。
8.4.1.4 试验开始前用显微镜检查培养细胞的近汇合和形态学情况。
8.4.1.5 弃去器皿中的培养基,然后将溶化琼脂与含血清的新鲜培养基混合,使琼脂最终质量浓度为
0.5%~2%,并吸取适宜体积加入至每只器皿内。细胞培养只能使用适合于哺乳动物细胞生长的琼脂。
这种琼脂/培养基的混合物宜为液态,并且温度适合于哺乳动物细胞。
注:各种不同分子量......
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