路径: 主页 > GB/T > 第654页 > GB/T 21769-2025 | 标准编号 | GB/T 21769-2025 (GB/T21769-2025) | | 中文名称 | 化学品 体外3T3中性红摄取光毒性试验方法 | | 英文名称 | Chemicals - In vitro 3T3 NRU phototoxicity test method | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A80 | | 国际标准分类 | 13.300 | | 字数估计 | 18,114 | | 发布日期 | 2025-10-05 | | 实施日期 | 2026-02-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 21769-2008 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 21769-2025: 化学品 体外3T3中性红摄取光毒性试验方法
ICS 13.300
CCSA80
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 21769-2008
化学品 体外3T3中性红摄取
光毒性试验方法
2025-10-05发布
2026-02-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替GB/T 21769-2008《化学品 体外3T3中性红摄取光毒性试验方法》,与GB/T 21769-2008
相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术内容变化如下:
a) 将“试验基本原则”更改为“试验原理”,更改了实验时关于光照处理时间的要求(见第5章,
2008年版的第4章);
b) 更改了摩尔消光系数的值(见6.1.1,2008年版的5.1.1);
c) 将“新陈代谢系统”更改为“代谢活化系统”,更改了试验中对代谢系统的要求(见6.1.3,2008年
版的5.1.3);
d) 增加了“试验准备”中,试验细胞选择的要求(见6.2.1),培养条件二氧化碳浓度调整的内容(见
6.2.2),受试物系列稀释溶液配制内容(见6.2.4),光源的全波段光谱波长范围和对UVA-照度
计定期校准的要求(见6.2.5);
e) 删除了试验准备中细胞株来源的内容(见2008年版的5.2.1),受试化学物质制备有关选用弱
性缓冲液时细胞二氧化碳培养条件的要求和阴性对照组的内容(见2008年版的5.2.4),阴性
对照组光敏检查的内容(见2008年版的5.4.2);
f) 增加了受试物浓度有关最高浓度降低至100μg/mL的内容(见6.3.1.2);
g) 将“阴性对照组”更改为“溶剂对照组”,更改了绝对光密度值的数值(见6.4.3,见2008年版的
5.4.3);
h) 增加了“避免中性红溶液结晶”的内容(见6.4.4);
i) 更改了试验步骤中细胞培养时间、孵育过夜时间、测定波长的要求(见6.5,2008年版的5.5);
j) 增加了中性红溶液配制方式内容、试验使用水的要求(见6.5.3.2);
k) 更改了光刺激因子(PIF)计算公式(见7.2.3,2008年版的6.2.3)、MPE临界值的要求(见
7.2.4,2008年版的6.2.4);
l) 删除了计算PIF和 MPE软件获取方式的内容(见2008年版的6.2.5);
m) 更改了试验结果预测模型的内容(见7.3.1,2008年版的6.3.1)、参考化学物质中文名称的内容
(见表2,2008年版的表1)、阴性结果PIF的要求(见7.3.4,2008年版的6.3.3)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。
本文件起草单位:广州海关技术中心、宁波海关技术中心、中检科健(天津)检验检测有限责任公司。
本文件主要起草人:温巧玲、潘丙珍、鲍佳生、潘芳、李志勇、陈德明、黄丽霞、黄雄俊、张梓龙、席静、
刘汉伟、易蓉、陈文锐、郑建国、谢文平。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---2008年首次发布为GB/T 21769-2008;
---本次为第一次修订。
化学品 体外3T3中性红摄取
光毒性试验方法
1 范围
本文件确立了化学品体外3T3中性红摄取光毒性试验的原理,规定了试验结果和试验报告的内容
要求,描述了试验方法。
本文件适用于化学品进行光毒性的筛选和检测的试验。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
辐照度 irradiance
入射到某一表面的紫外线(UV)或可见光(Vis)的强度。
注:单位为瓦每平方米(W/m2)或毫瓦每平方厘米(mW/cm2)。
3.2
光剂量 doseoflight
入射到某一表面的紫外线或可见光的量(强度与时间的乘积)。
注:以单位表面积的焦耳数表示,即焦耳每平方米(J/m2)或焦耳每平方厘米(J/cm2)。
3.3
在生物学实验中,紫外线波长为100nm~400nm的光波。
UVB(280nm~315nm)和 UVC(100nm~280nm)。UVB和 UVA的分界线通常在320nm,UVA可在
340nm处分为UV-A1和UV-A2。
3.4
细胞活性 celviability
测量某一细胞群总活性的参数(如细胞溶酶体摄取活性染料中性红),其数值取决于测定的终点和
试验所用的设计方案,并与细胞总数和/或细胞活力相关。
3.5
受试物分别在无光照(-Irr)和有光照[+Irr,无细胞毒性的紫外线/可见光(UV/Vis)照射]条件下
获得两组平行有效的细胞毒性浓度(IC50)通过计算得到的比值。
3.6
相对细胞活性 relativecelviability
与溶剂(阴性)对照组的相关性来表达的细胞活性。
注:对照组除了未经受试物处理外,整个试验过程与试验组一样(+Irr或-Irr)。
3.7
使细胞活性下降50%的受试物的浓度。
3.8
平均光效应 meanphotoeffect;MPE
受试物分别在无光照(-Irr)和有光照[+Irr,无细胞毒性的紫外线/可见光(UV/Vis)照射]条件下
获得两组浓度反应曲线通过数学分析导出的数值。
3.9
光毒性 phototoxicity
皮肤首次接触或全身应用某些化学物质继而暴露于光下所引发的急性毒性反应。
3.10
混合物 mixture
两种或两种以上不发生反应的化学物质组成的物质。
3.11
在一组特定条件(如溶剂、温度和波长)下,反映给定分子吸收光子效率的常数。
注:单位为升每摩尔厘米,即L/(mol·cm)。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPZ:氯丙嗪(Chlorpromazine)
DMSO:二甲基亚砜(DimethylSulfoxide)
NRU:中性红摄取(NeutralRedUptake)
UV/Vis:紫外线/可见光(Ultraviolet/VisibleLight)
5 试验原理
5.1 体外3T3中性红摄取(NRU)光毒性试验用于鉴别被光激活的受试物的潜在光毒性。
5.2 试验中的细胞毒性是以受试物和光照射处理18h~24h后,与受试物浓度相关的活性染料中性红
(NR,CAS号:553-24-2)摄取量来表示的。NR是一种弱的阳离子染料,极易以非离子扩散的方式穿透
细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。NR在pH接近中性的细胞质中不带电,但当其处于低pH的溶酶体腔
内时 会 变 成 正 电 荷。维 持 细 胞 溶 酶 体 腔 的 低 pH 值,需 要 腺 嘌 呤 核 苷 三 磷 酸 (Adenosine
机制,导致溶酶体膜的通透性增加、pH梯度降低,以及其他不可逆的变化,从而诱导细胞损伤,导致细
胞吸收和键合NR的能力下降从而区分活的、损伤的或死亡的细胞。
5.3 试验通过测定有光照(+Irr)和无光照(-Irr)条件下,永生化小鼠成纤维细胞系BALB/c3T3经
受试物作用后摄取活性染料NR能力的变化,计算受试物的光刺激因子(PIF)或平均光效应(MPE),以
此来判断受试物是否具有光毒性。
6 试验方法
6.1 试验前须知
6.1.1 光化学特性
许多种类的化学物质能诱导产生光毒性效应,它们的共同特点是在太阳光的波长范围内能够吸收
光能量。只有吸收足够的光量子才能发生光化学反应。因此,进行该试验前,宜按OECD试验指南101
(OECDTG101)的方法先测定受试物的UV/Vis吸收光谱。在适当的溶剂(如甲醇)中,如果化学物质
的摩尔消光系数(MEC)小于1000L/(mol·cm),则该化学物质不具有光反应性,无须进行体外3T3
中性红摄取光毒性试验,或其他测定不良光化学效应的生物学试验。通常情况下,该原则适用于所有受
试物,但有些化学物质根据其预期用途或可能的暴露条件,宜使用特定的指南(如药品按ICHS10测
试)。3T3NRU光毒性试验在化学物质光毒性连续试验中的作用,见附录A。
6.1.2 预测范围
对体外3T3中性红摄取光毒性试验的可靠性和相关性的评价结果表明,体外3T3中性红摄取光毒
性试验能预测动物和人类的体内急性光毒性效应。本试验不适用于预测受试物与光联合作用可能产生
的其他不良效应,如光遗传毒性、光过敏性或光致癌性。此外,本试验也不能阐明光毒性的间接机制、受
试物的代谢作用或混合物的效应。体外3T3中性红摄取光毒性试验阴性结果表明该受试物可能无须
进行其他试验(如光遗传毒性试验)。
6.1.3 代谢活化系统
体外3T3中性红摄取光毒性试验无须通过代谢活化系统进行。
6.2 试验准备
6.2.1 细胞
6.2.1.1 选用永生化小鼠成纤维细胞系BALB/c3T3。根据OECD第34号指导文件(OECDGD34)
的原则,如果培养条件能满足细胞的特殊需要,其他细胞或细胞系也可用于本试验,但应证明其等同性
(即对参考化学物质有适当反应)。
6.2.1.2 细胞到达实验室后应检查支原体污染,应使用无支原体污染的细胞。
6.2.1.3 按6.4规定的质量控制步骤定期检查BALB/c3T3细胞的紫外线敏感性非常重要。由于细胞
对UVA的敏感性随传代数的增多可能增高,因此,应使用可获得的最低传代数的BALB/c3T3细
胞,总传代次数应少于100次,光模拟器的谱能和细胞的敏感性的内容见附录B。如果使用更高传代次
数的细胞,则应提供数据来证明细胞符合本试验中的质量参数。
6.2.2 培养基和培养条件
常规细胞传代和试验过程应使用合适的培养基和培养条件。即对于BALB/c3T3细胞,用DMEM
(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)培养基补充10%新生小牛血清、4mmol/L谷氨酰胺、青霉素
(100IU)和链霉素(100μg/mL),温度条件为37℃,二氧化碳浓度(CO2)为5%~7.5%(视缓冲液不同
而定,见6.2.4.2)的条件下培养。根据使用的缓冲液,可以调整CO2 浓度水平。另外,细胞培养条件应
确保细胞或细胞系的细胞分裂周期时间在正常历史数据范围内。
6.2.3 培养物制备
6.2.3.1 将冷冻保存的细胞取出并复苏,用于光毒性试验前至少传代1次。
6.2.3.2 用于试验的细胞应接种到培养基中,并确保在试验结束时,也即在接种48h后测定细胞活性
时,培养物仍未达到完全汇合。对生长在96孔培养板中的BALB/c3T3细胞,细胞接种密度宜为每孔
1×104 个细胞。
6.2.3.3 对每种受试物,细胞以相同的方式接种在两块独立的96孔培养板上,整个试验过程中按相同
的培养条件培养,区别在于一块培养板进行照射处理(+Irr),而另一块培养板置于暗处(-Irr)。
6.2.4 受试物制备
6.2.4.1 除有稳定性数据证明储存液可以正常使用外,试验中的受试物应在使用当天现配现用。试验
进行照射前,化学物质的操作和细胞的初始处理都应避免将受试物暴露于具有光活化或光降解的光线
条件下。
6.2.4.2 受试物应溶解在平衡盐溶液中,如Earle’s平衡盐溶液(EBSS)、Hanks’平衡盐溶液(HBSS)或
其他生理平衡盐溶液,平衡盐溶液不应含有蛋白质成分和光吸收成分(如酚红等pH 指示剂和维生
素),以避免照射时产生干扰。因为照射期间,细胞要在CO2 培养箱外放置约50min,应避免培养基碱
化。如果细胞只在5%的CO2 条件下培养,应选用更强缓冲作用的平衡盐溶液。
6.2.4.3 在水中溶解度有限的受试物应先将其溶解在适当的溶剂中。如使用溶剂,溶剂的体积应当在
试验各培养物中保持一致,即在溶剂对照组和所有受试物浓度组中保持一致,并且溶剂在该浓度下无细
胞毒性。
6.2.4.4 受试物不溶于水时,宜使用二甲基亚砜(DMSO)或乙醇作为溶剂。如果受试物难溶于水、DM-
SO或乙醇,也可使用其他低细胞毒性的溶剂。使用前,应评估溶剂的特定性质,例如,是否与受试物反
应,是否会引发光毒性、使光毒性效应猝灭、影响自由基清除性质和/或化学稳定性。对于溶解在有机溶
剂DMSO或乙醇中的受试物,用同一溶剂制备8个浓度的系列稀释液,并将在有机溶剂中制备的8个
浓度的储备溶液转移到水性溶液(如EBSS或 HBSS)中,然后再应用于细胞。每种受试物的储备溶液
应以其在DMSO或乙醇中的最高溶解浓度制备,以使其在水性溶液中达到1000μg/mL的最高浓度。
在8个测试浓度的水性溶液中,溶剂的终浓度应保持一致,通常为1%(体积分数)。在有机溶剂中制备
的受试物转移到水性溶液时可能会产生沉淀。因此,应评估水性溶液剂量稀释液的溶解度并记录观察
结果。
6.2.4.5 不影响受试物稳定性的情况下,可以使用涡旋混合、超声处理和/或加热到适当温度等方法辅
助溶解。
6.2.5 照射条件
6.2.5.1 光源
6.2.5.1.1 选择合适的光源(如太阳光模拟器)和滤光片是光毒性试验的关键因素。体内光毒性反应通
常与UVA和可见光区域的光相关;与UVB相关性较小,但UVB具有较高的细胞毒性。随着UVB波
长从313nm变化至280nm,细胞毒性增加1000倍。合适的光源应发出全波段光谱(290nm~
700nm)。可使用滤光片来调整光谱,允许UVA和可见光透过(见图B.1)同时减弱 UVB的强度。此
外,所用波长、剂量和使用的光源设备(如开放或封闭系统)不应对测试系统产生不良影响(如红外区域
散发的热量、发射的波长等)。
6.2.5.1.2 使用太阳光模拟器模拟太阳光是一种理想的人造光源。经过滤的太阳光模拟器发出的光能
分布应接近于室外自然光。氙弧灯和(掺杂)汞金属的卤化物弧灯常被用作太阳光模拟器。由于所有太
阳光模拟器都会发射出相当数量的UVB,因此,它们应经过适当的过滤以减弱UVB的高细胞毒性。
6.2.5.1.3 试验中的细胞培养塑料材料含有UV稳定剂,因此应检测透过同类型96孔板盖的光谱。通
过滤光片或设备无法避免的滤波效应来减弱光谱,滤光片下测得的光谱不应偏离标准的室外自然光范
围。采用国际公认的室外自然光源标准---D65标准光源,见ISO 18909:2006。经滤过的太阳光模拟
器光谱分布资料见附录B的图B.1。
6.2.5.2 剂量
6.2.5.2.1 每次进行光毒性试验前,应使用合适的宽波段UVA-照度计对光强度(辐照度)做常规检测。
透过试验所用的96孔板盖的光辐照度也应检测。UVA-照度计需经光源校准。在更长的时间间隔
内,应使用外部校准的参考紫外线-可见光照度计在现场测量过滤光源的光辐照度,并在需要时调整宽
波段UVA-照度计的校准。或在配备了相同的光源/滤光片设备的校准实验室对 UVA-照度计进行定
期校准。
6.2.5.2.2 剂量为5J/cm2 的光线(UVA范围内测定)证实对BALB/c3T3细胞无毒性作用,但可以激
发化学物质产生光毒性反应。为在50min内达到5J/cm2 剂量,辐照度调整为1.7mW/cm2,见
图B.2。通过调整光照射时间和/或辐照度值以达到5J/cm2 剂量。光照射暴露时间按公式(1)计算:
t=
H ×1000
E×60
(1)
式中:
t ---照射时间,单位为分(min);
H ---照射剂量,单位为焦耳每平方厘米(J/cm2);
E ---辐照度(光强度),单位为毫瓦每平方厘米(mW/cm2)。
注:1焦耳(J)=1瓦特(W)×秒(s)。
6.2.5.2.3 如果使用其他细胞系或不同的光源,照射剂量应校准,以便选择对细胞无害并足以对标准光
毒性物质(见表2列明的参考化学物质)产生激发作用的剂量。
6.3 试验条件
6.3.1 受试物浓度
6.3.1.1 应当通过预试验确定有光照(+Irr)和无光照(-Irr)条件下受试物的浓度范围,预试验对于评
估受试物在试验开始时和60min内(或其他任何处理时间)的溶解度适用,因为溶解度可能在试验或暴
露期间发生变化。含受试物的细胞培养基的pH范围应为6.5~7.8。
6.3.1.2 受试物最高浓度应在生理试验条件下确定,例如应避免出现渗透性和极端的pH情况。根据
受试物性质不同,宜考虑限制受试物达到最高试验浓度的其他物理化学因素。溶解性低的受试物,如果
其最高溶解饱和浓度点不具有毒性,则应当用该物质所能达到的最高溶解浓度进行试验。对于无细胞
毒性受试物(产生沉淀前无IC50值),则应确定其在测定条件下的溶解度极限(限度浓度);在这种情况
下,可在主试验中包括两个或三个可能发生沉淀的浓度,然后在光毒性试验中排除这些浓度。受试物的
最高浓度不应超过1000μg/mL,在许多情况下,最高浓度可以降低至100μg/mL,因为在此限值无显
著细胞毒性(照射条件下)的化合物可视为无相关光毒性。在不照射的情况下,使用更高的最大浓度以
确定用于光刺激因子 (PIF)计算的IC50值。预试验时,受试物8个浓度应采用同一稀释因子,正式试验
时,根据预试验结果,合理设置稀释因子。
6.3.1.3 如果有资料(如范围确定预试验)表明,受试物在无光照试验条件下(-Irr)在达到限度浓度时
无细胞毒性,但在有光照条件下(+Irr)具有较高的细胞毒性,这时,有光照试验(+Irr)浓度范围的选择
应不同于无光照试验(-Irr)浓度范围的选择,以符合数据质量控制的要求。
6.4 质量控制
6.4.1 建立细胞光敏感性历史数据
通过评估暴露于逐渐增加的辐照度(光强度)后的细胞活性对工作细胞的光源敏感性进行检查,应
至少检查一次。应使用传代数最高的细胞来检查其对UV的敏感性。评估时应使用多个照射剂量,包
括高于体外3T3NRU光毒性试验使用剂量在内的多个剂量的照射水平都可用于这一检测。通过测定
光源的UV部件可较为容易地对这些照射剂量加以定量。细胞按6.2.3.2描述的密度接种,次日进行照
射(见试验步骤中6.5.2)。第三天使用中性红摄取法检测细胞活性。检测结果应表明最高无细胞毒性
剂量(如5J/cm2UVA),并足以对参考化学物质(见表2)进行正确分类。
6.4.2 检查当前试验细胞的光线敏感性
试验应符合的质量标准为:有光照(+Irr)条件下溶剂对照组的细胞活性与无光照(-Irr)条件下溶
剂对照组的细胞活性相比大于80%。
6.4.3 溶剂对照的活性
溶剂对照组中性红提取物测得的绝对光密度(OD540±10NRU)表明在试验的两天内以每孔1×104 个
细胞的密度接种细胞是否以正常的倍增时间生长。试验应符合质量标准为:溶剂对照组平均
OD540±10NRU≥0.4,即约为背景溶剂吸光值的20倍。
6.4.4 避免中性红溶液结晶
在NR与细胞一起孵育期间,应注意NR溶液的结晶,因为晶体可能会导致高变异性。中性红溶液
pH值的变化可能会触发NR晶体的形成。在细胞培养基中添加pH稳定剂如4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-
质量可能有差异,实验前宜评估储备的中性红是否适合用于试验。宜对细胞培养基中的NR溶液进行
过滤或离心。
6.4.5 阳性对照
6.4.5.1 进行体外3T3NRU光毒性试验时,应同时测试一种已知的光毒性化学物质。宜使用氯丙嗪
(CPZ,CAS号:50-53-3)。根据历史数据,试验可接受标准为:
a) CPZ有光照(+Irr):IC50=0.1μg/mL~2.0μg/mL;
b) CPZ无光照(-Irr):IC50=7.0μg/mL~90.0μg/mL;
c) 光刺激因子(PIF):PIF >6。
6.4.5.2 应监测阳性对照的历史数据。进行该试验的实验室应建立本实验室的历史数据,包括平均光
效应(MPE),以监测一段时间内阳性对照物的性能(见表2)。
6.4.5.3 其他光毒性化学物质,若其化学分类或溶解性已被评估过,可替代CPZ用作阳性对照物(见表2)。
6.5 试验步骤
6.5.1 第一天
6.5.1.1 加100μL培养基于96孔组织培养板的外围孔(空白对照),在其余孔中加入100μL密度为
1×105 个细胞/mL的细胞悬液(即每孔1×104 个细胞)。每次试验,应制备两块培养板,包括相同的受
试物浓度序列、溶剂对照。同样,对于阳性对照物也应准备两块培养板(包括溶剂对照)。
6.5.1.2 细胞培养18h~24h直至形成近半汇合单层。在此培养期间细胞恢复活力、贴附和指数
增长。
6.5.2 第二天
6.5.2.1 去除培养基,用150μL孵育缓冲液轻洗细胞。加100μL含适当浓度受试物或溶剂(溶剂对
照)的缓冲液到孔中。将受试物的8个不同序列浓度加到两块培养板上。在暗处将细胞与受试物共同
孵育60min。
6.5.2.2 两块培养板随机选择,其中一块用于检测细......
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