路径: 主页 > GB/T > 第654页 > GB/T 21827-2025 | 标准编号 | GB/T 21827-2025 (GB/T21827-2025) | | 中文名称 | 化学品 皮肤变态反应试验 局部淋巴结方法 | | 英文名称 | Chemicals - Test method of skin sensitization - Local lymph node assay | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A80 | | 国际标准分类 | 13.300 | | 字数估计 | 18,151 | | 发布日期 | 2025-10-05 | | 实施日期 | 2026-02-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 21827-2008 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 21827-2025: 化学品 皮肤变态反应试验 局部淋巴结方法
ICS 13.300
CCSA80
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 21827-2008
化学品 皮肤变态反应试验
局部淋巴结方法
2025-10-05发布
2026-02-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替 GB/T 21827-2008《化学品 皮肤变态反应试验 局部淋巴结方法》,与
GB/T 21827-2008相比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
增加了术语和定义一章(见第3章),缩略语一章(见第4章)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。
本文件起草单位:中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所、葫芦岛市疾病预防控制中心、
中科标准(宁德)科技有限公司。
本文件主要起草人:郑敏、杨国庆、李斌、程娟、吴智君、张意、鱼涛、陈宵、肖经纬、刘黎、林影。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---2008年首次发布为GB/T 21827-2008;
---本次为第一次修订。
引 言
变态反应试验局部淋巴结方法是检测外源性化学物质致皮肤变态反应常用的试验方法之一。该方
法在机体接触致敏原的诱导阶段,通过测定局部皮肤淋巴结内淋巴细胞的增殖活性,评估化学物质的皮
肤变态反应作用和强度。
2008年国家标准化管理委员会组织发布GB/T 21827-2008《化学品 皮肤变态反应试验 局部
淋巴结方法》(简称LLNA试验),规定了LLNA试验范围、试验基本原则、试验方法以及数据、报告的
内容和技术要求,是目前除豚鼠致敏试验以外唯一可用于评估受试物皮肤致敏性的试验方法。LLNA
为体内试验,试验结果以可量化的淋巴细胞增殖数据体现,且增殖程度与受试物剂量大小呈正比,这种
通过毒理学量效关系评估受试物致敏潜能的试验方法较传统致敏试验更加客观和可靠。与传统致敏试
验相比,LLNA试验周期短,无须致敏原二次接触,避免激发阶段对实验动物造成伤害,兼顾了动物福
利,符合动物实验的3R原则。目前GB/T 21827-2008发布实施已经十余年,在标准应用和实施过程
中,随着实验动物伦理要求受到越来越广泛的重视,与该方法有关的理论研究、实践和国际规范也在不
断发生变化;同时2023年强制性国家标准GB 14925-2023发布,对实验动物的环境与设施提出了更
为精准科学的规定和要求,因此有必要修订GB/T 21827-2008,以不断适应国内外相关标准的新变化
和新需求,确保LLNA试验在技术方法层面得到不断更新和完善。
LLNA试验与豚鼠致敏试验均可用于大多数潜在致敏化学物质的识别。LLNA试验开始前,实验
室需要充分了解受试物的化学结构、理化特征以及毒理学相关资料等信息,以确认是否可使用LLNA
试验的检测方法开展受试物皮肤变态反应评估。LLNA试验不是豚鼠皮肤致敏试验的替代试验,虽然
该试验方法具有优势,但也存在一定局限性,例如某些金属、皮肤刺激性或高分子量以及含有农药成分
的外源性化学物质等,其理化特性可能干扰LLNA试验方法的准确度,并存在假阳性结果或不适用情
况,这时需要考虑使用基准测试物质对LLNA试验体系进行确认,并采用传统的豚鼠致敏试验开展进
一步验证。
化学品 皮肤变态反应试验
局部淋巴结方法
1 范围
本文件确立了皮肤变态反应试验局部淋巴结方法的试验基本原则,规定了试验数据和报告的内容
要求,描述了试验方法和步骤。
本文件适用于化学品致皮肤变态反应的检测,提供用于评估剂量-反应关系的量化数据。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB 14925 实验动物 环境及设施
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
皮肤致敏性 skinsensitization
易感个体局部皮肤暴露于化学致敏原后诱导产生的一种皮肤变态反应。
3.2
受试物 testsubstance
进行致敏性评估的化学物质。
3.3
刺激指数 stimulationindex;SI
剂量组与阴性对照组淋巴细胞增殖率的比值。
3.4
参考化学物质 referencechemicals
用于对测试方法的准确度和可靠性进行评估验证的物质。
注:参考化学物质具有以下特征:(1)作用特点及作用机制已经得到证实;(2)化学种类明确,具有代表性;(3)测试
范围涵盖从强阳性、弱阳性到阴性的全部致敏反应类型;(4)根据试验类型和验证方法选择不同的参考化学
物质。
3.5
用作与试验受试物进行比对的标准致敏或非致敏物质。
注:基准物质具有以下特征:(1)一致可靠的物质来源;(2)与所测试物质种类具有结构和功能相似性;(3)明确的物
理和化学特性;(4)存在毒性效应相关的支持数据;(5)产生预估毒性效应范围内的剂量或浓度已知。
3.6
准确度 accuracy
试验结果与可接受参考值之间的接近程度。
注:准确度是评估测试方法性能和相关性的衡量标准,该术语通常与“一致性”互换使用,表示使用该测试方法得到
正确结果的比例。
3.7
可靠性 reliability
实验室内和实验室之间在不同时间使用同一方案进行试验时,试验方法能重复进行的程度。
注:通过实验室内和实验室间的重现性进行评估。
3.8
刺激指数等于3时所需的受试物估计浓度值。
3.9
刺激指数指示致敏性为阳性反应时所需的受试物估计浓度值。
3.10
不同实验室使用同一受试物和试验方案产生类似试验结果的程度。
注:也称为实验室间再现性。
3.11
同一实验室内的工作人员在不同时间使用同一受试物和试验方案产生类似试验结果的程度。
注:也称为实验室内再现性。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
lingofChemicals)
注:由联合国出版作为指导各国控制化学品危害、保护人类和环境的统一分类制度文件。
rLLNA:LLNA减少试验(reducedLLNA)
5 试验基本原则
本文件的基本原则是致敏化学物质在暴露后,能诱导染毒部位的引流淋巴结内淋巴细胞发生增殖
反应。增殖反应与受试物的剂量(过敏原的致敏潜力)成正比,因此可采用简单的定量方法获得客观、定
量的致敏试验数据。LLNA试验通过对剂量组与阴性对照组的增殖率即刺激指数(SI)进行比较,得到
剂量-反应关系,以此判断受试物致敏性强弱程度。当SI大于等于3时,受试物才需要作为潜在皮肤致
敏物开展进一步评估。LLNA试验使用体内放射性标记方法检测淋巴细胞的增殖程度,如果能完全匹
配LLNA试验关于操作准则的相关要求(见附录 A),也可使用其他检测终点评估淋巴细胞的增殖
情况。
6 试验方法
6.1 实验动物与饲养环境
6.1.1 动物选择
宜选择未生育、未受孕的8周~12周龄成年CBA品系雌性小鼠,体重变化小于平均体重的20%。
选择其他种属或性别的动物时,应有充足的证据表明在该试验中不存在种属和性别差异。
6.1.2 饲养环境
动物按组别分笼饲养。饲养环境应符合GB 14925关于SPF级屏障环境的规定,动物房温度保持
(23±3)℃,相对湿度30%~70%(50%~60%最好)。采用人工照明,保持12h光照和12h黑暗交替
循环。常规饲料喂饲,自由饮水。
6.2 动物分组及数量
受试物至少设立3个剂量组,1个阴性对照组,宜设立1个阳性对照。每组至少4只动物,收集每
只动物的试验数据。
6.3 剂量设计
在充分了解受试物化学结构、理化性质以及现有的急性毒性和皮肤刺激性试验资料基础上,从以下
浓度梯度中选择三个连续浓度作为受试物剂量:100%、50%、25%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%等。如
果没有受试物背景信息,可先开展剂量预筛选试验,选择100%作为受试物的最大剂量水平,注意高剂
量不应出现全身毒性反应和严重的皮肤刺激性。对照组除了不给予受试物,其他处理方式均与剂量组
相同。
6.4 对照
6.4.1 阳性对照
设立阳性对照可验证试验过程的可靠性以及实验室具备开展试验的能力。与阴性对照相比,阳性
对照在染毒后,其刺激指数(SI)应增加3倍以上。选择能产生明显的可重复的诱导作用,但不会出现严
重的皮肤刺激(即SI大于20)或全身毒性的浓度作为阳性对照的剂量。首选25%已基肉桂醛(CAS:
101-86-0)或5%巯基苯并噻唑(CAS:149-30-4)作为阳性对照物质(见A.1)。如果理由充分,也可使用
符合上述标准的其他阳性对照;
通常每次试验都要设立阳性对照组。在同一实验室的既往试验中,每6个月应使用已知阳性致敏
物质开展一次质量检查,以保证阳性对照结果一致。宜建立实验室内部阳性对照历史数据,保障实验室
内重现性。
6.4.2 阴性对照
一般选择赋形剂作为阴性对照。赋形剂应为非致敏物,不会与受试物发生化学反应影响试验结果。
6.4.3 赋形剂
宜选择体积比为4∶1的丙酮与橄榄油混合物、N,N-二甲基甲酰胺(CAS:68-12-2)、甲基乙基酮
(CAS:78-93-3)、丙二醇(CAS:57-55-6)或二甲基亚砜(CAS:67-68-5)作为受试物的赋形剂。同时在赋
形剂中加入适量的亲水物质以增加溶解度,湿润皮肤,避免液体流失。在特殊情况下,需要使用其他溶
剂(如临床或化学相关试剂)作为赋形剂时,应同时设立相应的溶剂对照,以排除阳性对照与赋形剂发生
化学反应的可能。不应使用只含水的赋形剂。
6.5 主要仪器
β-液闪仪或125I-计数仪。
6.6 预筛选试验
6.6.1 试验方法
预筛选试验可为LLNA正式试验的剂量设计提供指导。除了不对淋巴细胞增殖能力进行评估,其
他试验条件与LLNA正式试验保持一致。预筛选试验每个剂量组可使用1只~2只动物,双耳染毒后
每天观察实验动物的全身毒性反应、局部皮肤刺激体征,以及是否出现双耳红斑,按照表1对红斑进行
评分并记录。在第1天(染毒前)、第3天和第6天,使用测厚仪(如数字千分尺)测量耳朵厚度,第6天
动物处死后测量耳孔重量进行评估。试验前及试验第6天称量动物体重并记录。
表1 红斑评分
观察指标 评分
无红斑 0
极轻微红斑 1
清晰红斑 2
中到重度红斑 3
重度红斑形成焦痂 4
6.6.2 结果评价
6.6.2.1 毒性反应
实验动物出现较为明显的全身毒性反应时,提示受试物使用达到最大剂量,正式试验应选择比最大
剂量小一个级别的剂量作为高剂量。动物全身毒性反应主要表现为神经系统变化(如毛发竖起、共济失
调、震颤和痉挛);行为变化(如产生攻击性、活动减少);呼吸变化(如呼吸困难、喘息)以及体重减少5%
以上甚至死亡等。
6.6.2.2 结果判断
结果判断符合以下内容:
a) 染毒后任意一天剂量组动物双耳红斑评分大于或等于3和或耳朵测量厚度增加大于或等于
25%,即确认该受试物存在严重的局部皮肤刺激;
b) 剂量组动物双耳厚度与对照组比较存在统计学上的显著差异,同时耳朵测量厚度增加大于或
等于25%,也认为该受试物LLNA试验具有皮肤刺激性;
c) 如果出现组间动物双耳厚度统计学显著性差异,但剂量组耳朵测量厚度增加小于25%时,认
为该差异不具有生物学意义,与受试物染毒无关。
7 试验步骤
7.1 试验前准备
7.1.1 实验动物准备
实验动物在动物房适应性饲养5天,并于试验开始前检查动物体表,确认没有可见的皮肤损伤。实
验动物随机分组编号(不应在耳朵上做标记)。
7.1.2 受试物准备
赋形剂或溶剂应在考虑受试物最大试验浓度和可溶性基础上进行选择。将液体及可溶性固体受试
物配制成溶液稀释后使用。不可溶的固体受试物应选择合适赋形剂进行充分混悬后再开展试验。受试
物应每天新鲜配制。
7.2 正式试验
7.2.1 染毒及样本处理
第1天:将25μL受试物涂抹于试验动物的双侧耳背。阳性对照(如果需要)和阴性对照组分别涂
抹等量阳性对照物及赋形剂。
第2天~第3天:重复第1天操作。
第4天~第5天:不做处理。
第6天:记录每只动物的体重。所有组别的动物给予尾静脉注射250μL无菌PBS,PBS注射液中含有
20μCi(7.4×105Bq)的放射性标记物3H-甲基胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),或含有2μCi(7.4×104Bq)125I-碘脱
氧尿嘧啶核苷(125I-UdR)和10-5mol/L氟脱氧尿嘧啶核苷的混合标记物。5h后处死动物。摘取所有
动物的双侧耳后引流淋巴结浸泡于无菌PBS中。
局部刺激性检测指标还应包括动物皮肤红斑评分、双耳厚度以及处死动物耳孔重量的测量,检测方
法见6.6.1。
7.2.2 细胞悬液制备
取每只动物双侧耳后淋巴结,于200μm孔径不锈钢筛网轻柔研磨,制备成单细胞悬液,使用足量
PBS充分洗涤两次。细胞悬液加入适量5%三氯乙酸(TCA)溶液,于4℃静置沉淀18h。随后DNA
沉淀使用1mL5%TCA溶液重新混悬,转移至闪烁瓶中,加入10mL闪烁液进行3H-TdR计数,也可
将1mLTCA混悬液直接转移至γ计数管中进行125I-UdR计数。
7.2.3 细胞增殖测定(合并放射能)
使用β-液闪仪测定每只动物掺入淋巴细胞DNA中的放射性标记物3H-TdR每分钟衰变数,或使
同,检测结果分别以DPM/组(每组动物)或DPM/只(每只动物)表示。
7.3 rLLNA试验
rLLNA试验满足以下内容:
a) 当受试物为可能阴性致敏物时,在提供充足科学依据的前提下,可选择仅设立阴性对照和高剂
量两个组别开展rLLNA试验,以最大程度减少实验动物使用数量,同时要求该受试物在高剂
量下不应引起动物全身毒性反应和局部严重的刺激性;
b) rLLNA试验无法获取受试物与毒性效应之间的剂量-反应关系信息。当需要识别受试物的
潜在致敏性时,需要开展完整的LLNA试验进行评估。
7.4 临床观察
仔细观察并记录试验期间每只动物的临床体征、受试物局部皮肤刺激反应及系统毒性的情况。
7.5 体重
染毒前(第1天)及试验结束时(第6天)称量并记录动物体重。
7.6 数据处理与统计分析
7.6.1 结果计算
试验结果以SI表示。选择组内合并计算方式,应以组为单位,剂量组SI等于剂量组DPM 值除以
阴性对照组DPM值;选择单只动物计算方式,应以每只动物为单位,剂量组SI等于剂量组DPM 平均
值除以阴性对照组DPM平均值,阳性对照组SI等于阳性对照组DPM平均值除以阴性对照组DPM平
均值。设阴性对照组的平均SI等于1。
7.6.2 统计分析
为便于数据统计分析,SI宜采用单只动物计算方式。使用线性回归或 Wiliam’s检验进行LLNA
试验剂量-反应关系评估,使用最优剂量-反应关系曲线计算可信限(CI)。采用方差分析进行组间差异
性比较,Dunnett’s检验进行组间两两比较。统计分析时,可能存在组间方差不齐或其他问题,需要进
行数据转换或使用非参数统计分析。组内存在异常数据时,应选择合适的统计学方法,如用中位数替换
平均数,或者剔除异常离群值再进行分析。
7.6.3 结果评价
结果评价的内容如下:
a) LLNA试验剂量组SI大于或等于3时,试验结果判定为阳性,认为受试物有致敏性。
b) 当SI出现临界结果时,应进一步分析受试物与致敏作用是否存在剂量-反应关系、剂量-反应关
系强度、统计学差异显著性以及毒性反应是否与阳性对照组具有一致性等信息,综合评估受试
物是否具有致敏性。
c) 结果评价宜考虑受试物是否与已知致敏物的结构或功能存在相似性、是否会引起试验动物严
重的皮肤刺激等情况,并结合受试物的剂量-反应关系进行具体分析。
d) LLNA试验可能出现假阳性结果时,应全面了解受试物的背景信息,如物理性质、是否存在与
致敏性相关的特殊化学结构基团、既往LLNA试验、豚鼠致敏试验、其他毒理学试验数据或人
群调查资料等信息。尤其是对于不具有特殊化学结构但能产生明显皮肤刺激性的物质,其
LLNA试验高剂量组出现轻微阳性致敏反应时,该结果通常提示为假阳性,应进一步分析和
确认。
8 试验数据和报告
8.1 数据
试验数据以表格形式汇总呈现。选择合适的计算方法(见7.6.1),如果使用组内合并数据,应列出
剂量组DPM平均值或中位数以及SI平均值;如使用单只动物数据,应列出每只动物的DPM 值、组内
DPM平均值(以均数±标准差表示)以及SI平均值。
8.2 试验报告
试验报告应包括以下内容。
a) 受试物信息:
1) 名称和识别码(包括CAS号、来源、纯度、杂质和批号);
2) 物理性质及化学性质;
3) 混合物提供组成成分和相对含量。
b) 赋形剂:
1) 名称和识别码(包括纯度、浓度、使用体积);
2) 选择的依据。
c) 实验动物:
1) CBA小鼠品系、来源;
2) 动物微生物学情况(如有可提供);
3) 动物年龄、性别和数量;
4) 动物来源、饲养条件等。
d) 试验条件:
1) 受试物制备和使用的详细信息;
2) 剂量选择依据(如果进行了剂量预筛选试验,需要提供相应剂量及试验数据);
3) 赋形剂和受试物浓度、受试物使用量;
4) 饲料和饮水情况(包括类型和来源);
5) 主要仪器和设备(包括生产厂家和型号)。
e) 可靠性检查:
1) 受试物、使用浓度和赋形剂的信息说明;
2) 本次试验采用的阳性对照信息说明;
3) 实验室既往关于阳性对照和阴性对照的历史数据说明;
4) 如未设立阳性对照,应提供同一实验室最近6个月以内的阶段性阳性对照数据,并说明
理由;
5) 如既往阳性对照存在假阴性历史结果,应排除使用该阶段性阳性对照历史数据对试验准
确性造成的干扰;
6) 试验程序变化的记录(如试验人员、仪器设备、实验动物来源变化以及测试方法变更等信
息),对实验室历史数据是否产生影响;
7) 推荐的基准测试物质使用情况(包括基准测试物质的结构功能、理化性质与受试物是否相
似、是否有LLNA试验或其他动物试验数据支持等);
8) 建议1年内开展不少于10次的阳性对照测试,确保阳性对照结果一致,以证明实验室开
展LLNA试验的熟练程度。
f) 试验结果:
1) 染毒前和试验结束时每只动物的体重;
2) 列表给出各个组别的DPM 平均值或中位数、DPM 可信区间及SI平均值;每只动物的
DPM值和SI值;
3) 剂量-反应关系分析和数据统计分析;
4) 每只动物出现毒性反应的时间和观察到的临床体征,尤其是注意受试部位皮肤的刺激
反应。
g) 结论:
1) 对试验结果、剂量-反应关系和统计分析方法进行简要说明;
2) 做出结论认为该受试物是否为致敏物。
附 录 A
(资料性)
拟采用类似LLNA试验评估皮肤变态反应的操作准则(PS)
A.1 测试方法基本组成
测试方法基本组成满足以下内容。
a) 局部涂抹受试物于小鼠的双耳背侧。
b) 在受试物施加部位排出的淋巴结中进行淋巴细胞增殖测定。
c) 在皮肤致敏的诱导阶段评估淋巴细胞增殖情况。
d) 受试物的最高剂量不应引起小鼠全身毒性反应和或局部皮肤过度刺激。阳性对照物最高剂量
不低于相应推荐参考物质的LLNA试验EC3值(见表A.1),且不会对小鼠产生全身毒性反应
和或过度的局部皮肤刺激。
e) 试验设立阳性对照和阴性对照。
f) 每个剂量组至少使用4只动物。
g) 可收集每只或成组动物的数据。
以上所有条件需要全部满足,才可使用类似LLNA试验的检测方法开展皮肤变态反应评估。
A.2 推荐参考物质清单识别标准
参考物质清单识别标准满足以下内容:
a) 参考物质应在LLNA试验可测量或可预测的反应范围之内并能代表皮肤致敏潜能的物质类
型中进行选择;
b) 参考物质应具有明确的化学结构;
c) 每一种参考物质的LLNA试验结果需要有豚鼠试验或人体数据支持;
d) 参考物质已经商品化,容易获得。
宜使用表A.1推荐的18种最低推荐参考物质或4种可选参考物质及其相应溶剂进行类似LLNA
试验方法的评估和验证;或者选择符合识别标准的其他物质并提供充分的理由进行说明。
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