路径: 主页 > GB/T > 第625页 > GB/T 25165-2010 | 标准编号 | GB/T 25165-2010 (GB/T25165-2010) | | 中文名称 | 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法 | | 英文名称 | Protocol of identification of bovine, caprine, ovine and porcine derived materials in gelatin -- Real time PCR method | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B43 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 6,668 | | 发布日期 | 2010-09-26 | | 实施日期 | 2011-05-01 | | 引用标准 | GB/T 6682; GB 6783; GB/T 14699.1; GB/T 27403-2008 | | 标准依据 | 国家标准批准发布公告2010年第6号(总第161号) | | 发布机构 | 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会 | | 范围 | 本标准规定了明胶中牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测。该方法的捡出限为0.1%。 | GB/T 25165-2010: 明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光PCR法
GB/T 25165-2010 英文名称: Protocol of identification of bovine, caprine, ovine and porcine derived materials in gelatin -- Real time PCR method
ICS 65.020.30
B43
中华人民共和国国家标准
明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法
实时荧光PCR法
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
中国国家标准化管理委员会发布
前言
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人:陈颖、吴亚君、袁飞、王晶、徐宝梁、张舒亚、杨海荣、王斌、赵勇胜。
明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法
实时荧光PCR法
1 范围
本标准规定了明胶中牛、羊、猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。
本标准适用于明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测。
该方法的检出限为0.1%。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有
的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 6783 食品添加剂 明胶
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
4 原理
利用实时荧光PCR技术,根据不同物种的特异性基因序列对牛、羊、猪源性成分进行鉴定。利用裂
解液破碎细胞,酚、三氯甲烷抽提蛋白质,异丙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行内参照基
因的实时荧光PCR检测,以确定样品DNA的提取效率;通过特异性引物和标记荧光物质探针进行牛、
羊、猪源性成分的实时荧光PCR扩增,根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定,实
现对明胶中牛、羊、猪源性成分的定性分析。
5 检测用引物和探针
内参照引物探针序列及牛、羊、猪特异性引物探针序列见表1。
6 试剂
苯酚(Tris饱和酚,pH8.0)、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、70%乙醇。
除另有规定外,所有试剂均为分析纯。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。
7 配制溶液
7.1 裂解液
7.2 实时荧光PCR反应混合液
12.5μL反应体系包括:1U~2U(Unit,酶学单位)的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5mmol/L~
4.0mmol/L的 Mg2+、0.2U~1U 的 UNG 酶、0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs、0.2mmol/L~
0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料(某些荧光PCR仪不需要ROX校正)。
8 仪器设备
8.1 实时荧光PCR仪。
8.2 恒温水浴锅。
8.3 离心机:离心力不小于3000g。
8.4 微量移液器:0.5μL~10μL,10μL~100μL,20μL~200μL,200μL~1000μL。
8.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
8.6 pH计。
8.7 天平:感量0.01g。
9 样品采集
按照GB 6783对食用明胶采样,按照GB/T 14699.1对饲料明胶采样,将实验样品粉碎,充分混合
均匀后待用。
10 检验步骤
10.1 DNA提取
称取样品500mg于50mL离心管中,加入5mL裂解液,室温过夜后置于65℃恒温箱中温育
1h~2h,取出后迅速加入与裂解液等体积的室温酚-三氯甲烷-异戊醇(25∶24∶1)(注意:如果样品因
温度下降凝固而无法获得上清,可将样品再次放入65℃恒温箱中使其重新液化),颠倒混匀,室温下
12000g离心10min,转移上清至另一灭菌的离心管中,加入等体积的三氯甲烷-异戊醇(24∶1),颠倒
混匀,室温下12000g离心10min,转移上清至另一灭菌的离心管中,加入0.8倍异丙醇或2倍体积的
预冷无水乙醇混匀,-20℃放置0.5h~1h,4℃下12000g离心10min~15min,弃上清,用70%乙醇
洗涤沉淀一次,4℃下12000g离心10min,弃上清,室温下晾干。加入50μL 双蒸水,溶解沉淀,
-20℃保存。
也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。
DNA提取过程中以水代替样品设置提取空白对照,并置于每个提取系列中的最后。
10.2 实时荧光PCR扩增
反应体系的体积为25μL,体系组成见表2。
11.1 PCR有效性判定
空白对照:无FAM荧光信号,相应Ct值 >40.0。
阴性对照:无FAM荧光信号,相应Ct值 >40.0。
阳性对照:有FAM荧光信号,且FAM通道出现明显的扩增曲线,Ct值≤36.0。
否则判定为PCR无效。
11.2 DNA提取有效性判定
在同时进行的阴性、阳性、空白对照实验结果正常的情况下,被检测样品应有FAM荧光信号检出,
且FAM通道出现明显的扩增曲线,Ct值≤40.0。
否则DNA提取无效,应重新提取DNA,直至Ct值≤40.0。
11.3 检测结果判定
在符合11.1和11.2的情况下,使用牛、羊、猪特异性引物和探针对被检样品进行检测:
如有FAM荧光检出,且Ct值≤36.0,则判定样品含有相应的动物源性成分;
如Ct值 >40.0,则判定为不含相应的动......
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