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[PDF] GB/T 38132-2019 - 自动发货. 英文版

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GB/T 38132-2019 英文版 150 GB/T 38132-2019 3分钟内自动发货[PDF] 转基因植物品系定量检测数字PCR法 有效

基本信息
标准编号 GB/T 38132-2019 (GB/T38132-2019)
中文名称 转基因植物品系定量检测数字PCR法
英文名称 Quantitative determination of genetically modified plants by digital PCR method
行业 国家标准 (推荐)
中标分类 A40
国际标准分类 07.080
字数估计 10,196
发布日期 2019-10-18
实施日期 2019-10-18
起草单位 上海市计量测试技术研究院、苏州百源基因技术有限公司、中国检验检疫科学研究院、中国农业科学院生物技术研究所、中国测试技术研究院生物研究所、甘肃国研检验检测有限公司、四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国科学院上海高等研究院
归口单位 全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)
提出机构 全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC 387)
发布机构 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会

GB/T 38132-2019 Quantitative determination of genetically modified plants by digital PCR method ICS 07.080 A40 中华人民共和国国家标准 转基因植物品系定量检测数字PCR法 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 中国国家标准化管理委员会 发 布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位:上海市计量测试技术研究院、苏州百源基因技术有限公司、中国检验检疫科学研 究院、中国农业科学院生物技术研究所、中国测试技术研究院生物研究所、甘肃国研检验检测有限公司、 四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国科学院上海高等研究院。 本标准主要起草人:梁文、付伟、李亮、刘刚、李妍、车团结、周李华、林华、杨镇州、朱鹏宇、马丽侠、 樊春海、王丽华、张莹。 转基因植物品系定量检测数字PCR法 1 范围 本标准规定了转基因植物品系的数字PCR定量检测方法。 本标准适用于种子及物理加工种子样品中转基因玉米 MON810品系、MON89034品系、MIR162 品系,转基因大豆GTS-40-3-2品系,转基因水稻克螟稻品系,转基因棉花GHB119品系,转基因油菜 RT73品系的数字PCR法定量检测。 本方法的定量检测限为0.1%(质量分数)。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.1 转基因产品检测 通用要求和定义 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 19495.7 转基因产品检测 抽样和制样方法 SN/T 4853(所有部分) 转基因大米定量检测 数字PCR法 3 术语和定义、缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 外源DNA片段插入受体作物基因组后重组产生的邻接区序列。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PLD:磷脂酰胆碱磷脂水解酶基因(PhospholipaseDgene) 数字PCR其技术原理是通过将原始PCR反应体系进行分割,进而对所有小的反应体系进行扩增 并后续检测。通过对反应体系进行有限的分割,从而使整个反应体系可以更加耐受核酸抑制因子,并且 更加稳定、准确、快速地对痕量的转基因成分进行精准鉴定。 目前数字PCR包括芯片式数字PCR和微滴式数字PCR两种。芯片式数字PCR通过微流控芯片 实现对原始反应体系的分割,这种分割方式具有稳定性好、均一性好的优点,但试验成本相对较高;微滴 式数字PCR通过产生微小油包水体系实现反应体系的分割,这种分割方式反应速度快,分割成本更低。 为了实现转基因植物品系数字PCR定量检测,本标准通过数字PCR扩增反应直接得出转基因植 物外源基因(品系特异序列)和植物内源基因的拷贝数含量。样品DNA中的外源基因和内源基因的拷 贝数的比值(百分数)即为样品中相应的转基因植物品系的相对百分含量。 5 试剂和材料 除另有说明,本方法使用的试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。 5.1 植物基因组DNA提取试剂盒:推荐针对不同的样品选取不同的基因组提取试剂盒。 5.2 数字PCR预混液:含有镁离子、dNTPs和具有5'-3'外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字 PCR专用预混试剂,推荐按照不同的数字PCR仪说明书选择。 5.3 引物及探针:检测不同植物品系的引物探针序列具体信息见表1。扩增序列的信息参见附录A。 表1 转基因植物外源基因及内源基因的引物和探针序列 靶标 类别 名称 序列 玉米 MON810品系 特异序列 外源 玉米 MON89034 品系特异序列 外源 探针 FAM-ATCCCCGGAAATTATGTT-MGB 玉米 MIR162品系 特异序列 外源 玉米基因Adh-1 内源 下游引物 CCACTCCGAGACCCTCAGTC 大豆GTS-40-3-2 品系特异序列 外源 上游引物 TAGCATCTACATATAGCTTC 下游引物 GACCAGGCCATTCGCCTCA 大豆基因Lectin-1 内源 上游引物 GCCCTCTACTCCACCCCCA 下游引物 GCCCATCTGCAAGCCTTTTT 水稻克螟稻品系 特异序列 外源 下游引物 CCGATATGCCTGCCCATCT 表1(续) 靶标 类别 名称 序列 水稻基因 PLD 内源 上游引物 TGGTGAGCGTTTTGCAGTCT 棉花GHB119品系 特异序列 外源 棉花基因 Adhc 内源 油菜RT73品系 特异序列 外源 油菜基因 PEP 内源 上游引物 CCCTTGTGAAGCTCGACATC 6.1 数字PCR仪。 6.2 分析天平:感量0.1mg。 6.3 生物安全柜。 6.4 核酸定量仪。 6.5 涡旋振荡仪。 6.6 移液枪:量程0.1μL~2.5μL;量程0.5μL~10μL;量程10μL~100μL;量程100μL~1000μL。 7 操作步骤 7.1 抽样 按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.7的规定执行。 7.2 制样 按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.7的规定执行。 7.3 DNA模板制备 按照GB/T 19495.1和GB/T 19495.3的规定执行。 7.4 DNA模板浓度控制 采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的核酸定量仪或方法测定DNA溶液 的浓度,具体操作步骤参照相关仪器或试剂盒说明书。然后根据植物基因组的相对分子质量大小计算 DNA的拷贝数浓度。浓度要求符合SN/T 4853的规定。 7.5 数字PCR扩增方法 7.5.1 数字PCR反应体系 转基因玉米 MON810品系、MON89034品系、MIR162品系,转基因大豆GTS-40-3-2品系,转基因 水稻克螟稻品系采用双重数字PCR反应体系见表2。转基因棉花GHB119品系,转基因油菜RT73品 系采用单重数字PCR反应体系见表3。数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家、型号的数字 PCR仪做相应调整,并保持各引物探针组分终浓度不变。每个DNA模板应进行3个平行数字PCR扩 增反应。 表2 双重数字PCR反应体系 PCR反应试剂 终浓度 体积 内源基因上游引物(10μmol/L) 0.5μmol/L 1μL 内源基因下游引物(10μmol/L) 0.5μmol/L 1μL 内源基因探针(5μmol/L) 0.1μmol/L 0.4μL 外源基因上游引物(10μmol/L) 0.5μmol/L 1μL 外源基因下游引物(10μmol/L) 0.5μmol/L 1μL 外源基因探针(5μmol/L) 0.1μmol/L 0.4μL 2×数字PCR预混液 1× 10μL DNA模板 - 2μL ddH2O(无菌水) - 3.2μL 表3 单重数字PCR反应体系 PCR反应试剂 终浓度 体积 2×数字PCR预混液 1× 10μL 外源/内源基因上游引物(10μmol/L) 0.9μmol/L 1.8μL 外源/内源基因下游引物(10μmol/L) 0.9μmol/L 1.8μL 探针(10μmol/L) 0.25μmol/L 0.5μL DNA模板 - 2μL ddH2O(无菌水) - 3.9μL 7.5.2 数字PCR反应程序 数字PCR反应程序如表4和表5所示。 表4 微滴数字PCR的反应程序 步骤 时间和温度 循环数 热激活及变性 10min/95℃ 1 退火延伸 1min/56℃ 变性 30s/94℃ 酶失活 10min/98℃ 1 表5 芯片数字PCR反应程序 步骤 时间和温度 循环数 热激活及变性 10min/96℃ 1 退火延伸 2min/60℃ 变性 30s/98℃ 退火延伸 2min/60℃ 1 注:不同芯片平台可根据说明书对除退火延伸外步骤中的温度和时间做相应调整。 7.5.3 对照数字PCR反应的设定 试验中应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含品系特异序列的转基因植物品系基因组DNA 做阳性对照,含相同内源基因的非转基因植物基因组DNA做阴性对照,以水作为空白对照。各对照 PCR反应体系中,除模板外,其余组分及PCR反应条件与7.5.1和7.5.2相同。 8 结果分析与表述 8.1 质量控制 根据数字PCR结果中阴性对照的终点荧光值设定阈值限,该阈值限应将同一样品中阴性反应微小 单元和阳性反应微小单元有效区分。 阴性对照有内源基因扩增且阴性对照和空白对照均无外源基因扩增。 扩增平行重复测试结果(转基因品系百分含量)的相对标准偏差应小于或等于25%。 以上要求其中一条不符合,应重新进行试验,重新进行的试验应从制备测试样品开始。 8.2 结果分析 按照式(1)计算测试样品的转基因品系百分含量: P= B ×100% (1) 式中: P ---转基因植物品系的百分含量; A ---转基因植物品系外源基因拷贝数; B ---转基因植物内源基因拷贝数。 8.3 结果表述 8.3.1 ......
英文版: GB/T 38132-2019  
相关标准:GB/T 38133-2019  GB/T 43778-2024  
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