路径: 主页 > GB/T > 第673页 > GB/T 38164-2019 | 标准编号 | GB/T 38164-2019 (GB/T38164-2019) | | 中文名称 | 常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法 | | 英文名称 | Identification of animal ingredient from common livestock and poultry - Real-time PCR | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A40 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 14,160 | | 发布日期 | 2019-10-18 | | 实施日期 | 2019-10-18 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 38164-2019: 常见畜禽动物源性成分检测方法 实时荧光PCR法
ICS 07.080
A40
中华人民共和国国家标准
常见畜禽动物源性成分检测方法
实时荧光PCR法
Real-timePCR
2019-10-18发布
2019-10-18实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
中国国家标准化管理委员会 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。
本标准起草单位:中国检验检疫科学研究院、大连海关、青岛海关、上海海关、沈阳海关。
本标准主要起草人:陈颖、韩建勋、郑秋月、高宏伟、张舒亚、王娉、孙敏、邢冉冉、张九凯、邓婷婷、
王金玲、徐君怡。
常见畜禽动物源性成分检测方法
实时荧光PCR法
1 范围
本标准规定了常见畜禽动物源性成分的实时荧光PCR检测方法。
本标准适用于肉及加工品、内脏、乳、动物饲料中黄牛、牦牛、水牛、绵羊、山羊、猪、骆驼、马鹿、梅花
鹿、驯鹿、兔、狗、鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽子、火鸡、猫、狐狸、水貂、貉、鼠物种成分的Taqman探针实时荧光
PCR定性检测。
检出限(LOD)1%(质量分数)。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403-2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
GB/T 34796 水溶液中核酸的浓度和纯度检测 紫外分光光度法
GB/T 35918 动物制品中动物源性检测基因条码技术 Sanger测序法
3 术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
实时荧光PCR real-timePCR
在PCR反应体系中加入荧光基团,通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。
3.1.2
Ct值 cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
3.2 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
COⅠ:细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(CytochromeCoxidaseⅠ)
cytb:细胞色素b(Cytochromeb)
TaqDNA聚合酶:耐热DNA聚合酶(TaqDNApolymerase)
4 原理
通过物种特异性引物及探针进行畜禽动物源性成分的实时荧光PCR扩增,根据PCR扩增反应中
每一个循环产物荧光信号进行判定,实现对常见畜禽动物源性成分的定性检测。
5 检测用引物和探针
内参照引物探针序列和常见畜禽动物特异性引物探针序列见表1。
表1 引物探针序列
目标物种 序 列 基因来源
内参基因
18SrRNA基因
黄牛
cytb基因
牦牛
F:GACTAATATTCGAAAATCC
水牛
F:TTCATTGAYCTCCCTGCTCC
ATP8基因
骆驼
F:ATTCTTTGCCTTCCACTTCA
梅花鹿
COⅠ基因
马鹿
F:TAGTTATGTAAACAAGACTG
驯鹿
F:CTCCCAGTACGAAAGGACCA
表1(续)
目标物种 序 列 基因来源
山羊
F:TGGAGTAATCCTCCTGCTC
R:GGATTGCTGAAAGAAGATTA
绵羊
P:5'FAM-TATTACCAACCTCCTTT-3'MGB NFG
cytb基因
鸽子
F:GAGCAACCCCTCAACGTACT
F:GGCCACACAAATCCTCACAG
F:CCACCGCGAATCCTCAAT
鹌鹑
R:GGGTGACGGGCGGTATG
P:5'FAM-ATGGCCCTGAGGCAC-3'Eclipse
12SrRNA基因
水貂
R:GCTTCTTCCTTGAGTCTTA
F:CTGCTGTCTTACTACTTCTA
F:TAATCGTCACCGCACATGCC
ATP8基因
P:5'FAM-ATCACTTAGTCCAATAAGG-3'MGB NFG
D-loop基因
狐狸
COⅠ基因
F:AATCTTGCCTGGGTTTGGAA
COⅠ基因
表1(续)
目标物种 序 列 基因来源
P:5'FAM-CTATGAATCCGGGCCTC-3'TAMRA
ND1基因
火鸡
P:5'FAM-CTTGCTTGAGCCACACC-3'MGB NFG
12SrRNA基因
F:CCGCCCAATCACCCAAA
R:GCCTCCGATTCATGTTAAGA
注:F代表上游引物;R代表下游引物;P代表探针。
6 试剂
除另有规定外,所有试剂均为分析纯。试验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。
6.1 三氯甲烷。
6.2 异丙醇。
6.3 无水乙醇。
6.4 氢氧化钠溶液(10mol/L):在160mL双蒸水中加入80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后,冷却至室
温,再加双蒸水定容至200mL。
6.5 Na2-EDTA溶液(500mmol/L,pH8.0):称取18.6gNa2-EDTA,加入70mL双蒸水中,再加入适
量氢氧化钠溶液(6.4),加热至完全溶解后,冷却至室温,用氢氧化钠溶液(6.4)调pH至8.0,加双蒸水定
容至100mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
6.6 Tris-HCl溶液(1mol/L,pH8.0):称取121.1gTris溶解于800mL双蒸水中,用 HCl调pH至
8.0,加双蒸水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
6.7 CTAB提取缓冲液(pH8.0):称取4.0gCTAB,16.364gNaCl,加入20mL1mol/LTris-HCl溶
液(pH8.0)(6.6),8mL500mmol/LNa2-EDTA溶液(pH8.0),先用70mL双蒸水溶解,再定容至
200mL,在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
6.8 CTAB沉淀液:称取1.0gCTAB,0.467gNaCl,先用70mL双蒸水溶解,再定容至200mL,在
103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。
6.9 蛋白酶K(670U/mL):称取0.10g酶活为33.5U/mg(Unit,酶学单位)的蛋白酶K干粉,加入
5mL双蒸水,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解,分装成小份贮存于-20℃。
6.10 PCRMasterMix(2×),也可用等效的实时荧光PCR预混液。
7 仪器设备
7.1 实时荧光PCR仪。
7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
7.3 恒温水浴锅。
7.4 离心机:离心力≥12000g。
7.5 pH计:0.01级。
7.6 天平:感量0.1g、0.01g、0.001g。
8 检验步骤
8.1 样品前处理
8.1.1 总则
对样品进行前处理,处理后的样品分成三等份,包括待检样品、复检样品和留存样品。
8.1.2 固体样品
依次用70%乙醇和双蒸水冲洗2次~3次,收集到干净50mL离心管或干净密封袋中,-20℃以
下冻存。
8.1.3 半固体、液体样品
混匀后直接分装到干净50mL离心管或干净密封袋中,-20℃以下冻存。
8.2 DNA提取
按照GB/T 35918的方法提取。
也可用等效DNA提取试剂盒提取DNA。
8.3 DNA浓度和纯度的测定
按照GB/T 34796方法测定并计算DNA的浓度,判定DNA和纯度。
注:实测荧光PCR扩增试验前,宜将DNA浓度稀释至5ng/μL~50ng/μL范围。
8.4 实时荧光PCR扩增
检测过程中设置阳性对照、阴性对照和空白对照。
用含目标成分的样品或含目标片段的阳性质粒作为阳性对照,以不含目标成分的样品或不含目标
片段的阴性质粒作为阴性对照,以双蒸水为空白对照。
样品和对照设置2个平行的反应体系,分别进行靶向基因和内参基因扩增,以Ct平均值作为最终
结果。反应体系的体积为25μL,体系组成见表2,反应参数见表3。
表2 实时荧光PCR反应体系组成
试剂名称 终浓度 体积/μL
PCRMasterMix(2×) 1× 12.5
上游引物 (10μmol/L) 200nmol/L 0.5
下游引物 (10μmol/L) 200nmol/L 0.5
探针(10μmol/L) 200nmol/L 0.5
DNA模板 (5ng/μL~50ng/μL) - 5.0
双蒸水 - 6.0
表3 实时荧光PCR反应参数
待测物 反应参数
内参照 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
黄牛 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
牦牛 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
水牛 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
骆驼 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
梅花鹿 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
马鹿 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
驯鹿 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
山羊 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
绵羊 95℃10min;95℃15s,62℃1min,40个循环
猪 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
狗 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
鸽子 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
火鸡 95℃10min;95℃15s,60℃1min,40个循环
狐狸 95℃5min;95℃15s,60℃40s,40个循环
貉 95℃5min;95℃15s,60℃40s,40个循环
鸡 95℃5min;95℃15s,60℃40s,40个循环
鼠 95℃10min;95℃15s,62℃40s,40个循环
鸭 95℃2min;95℃15s,65℃80s,40个循环
鹅 95℃2min;95℃15s,65℃80s,40个循环
鹌鹑 95℃2min;95℃15s,65℃80s,40个循环
兔 95℃10s;95℃5s,60℃30s,40个循环
水貂 95℃10s;95℃5s,52℃10s,72℃34s,40个循环
猫 95℃10s;95℃5s,52℃10s,72℃34s,40个循环
9 质量控制
以下条件有一条不满足时,试验视为无效:
a) 内参照:荧光通道有荧光信号检出,且出现典型的扩增曲线,Ct值< 30.0;
b) 空白对照:荧光通道无荧光信号检出,Ct值应≥40.0;
c) 阴性对照:荧光......
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