路径: 主页 > GB/T > 第672页 > GB/T 44830-2024 | 标准编号 | GB/T 44830-2024 (GB/T44830-2024) | | 中文名称 | 酶联免疫试剂盒检测通则 | | 英文名称 | General rules for determination of enzyme-linked immunosorbent assay kit | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | A40 | | 国际标准分类 | 07.080 | | 字数估计 | 10,172 | | 发布日期 | 2024-10-26 | | 实施日期 | 2024-10-26 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 44830-2024
General rules for determination of enzyme-linked immunosorbent assay kit
酶联免疫试剂盒检测通则
ICS 07.080
CCS A 40
中华人民共和国国家标准
2024-10-26发布
2024-10-26实施
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会 发 布
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规
定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中国标准化研究院提出并归口。
本文件起草单位：江南大学、中国标准化研究院、东莞市森迈德生物科技有限公司、南京微测生物
科技有限公司、深圳市易瑞生物技术股份有限公司、北京索莱宝科技有限公司、深圳市达科为生物工程
有限公司、广州敏特生物技术有限公司、北京博奥森生物技术有限公司、北京健平金星生物医药有限
公司。
本文件主要起草人：郭玲玲、胥传来、匡华、徐丽广 、刘丽强、孙茂忠、胥欣欣、宋珊珊、
瞿爱华、吴晓玲、郝昌龙、吴爱红、赵琳、刘海森、黄英霞、肖理文、赵皖、付辉、莫秋华、马玉岭、
姜维、彭立胜、邬晓乐、邹检平。
酶联免疫试剂盒检测通则
1 范围
本文件描述了酶联免疫试剂盒的检测过程，规定了酶联免疫试剂盒检测的一般要求和结果报告
要求。
本文件适用于酶联免疫试剂盒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用
于本文件。
GB/T 4889-2008 数据的统计处理和解释 正态分布均值和方差的估计与检验
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语和定义
下列术语和定义使用于本文件。
3.1
阴性样品 negative sample
经实验室标准分析方法或经典方法未能检出目标分析物的样品。
3.2
阳性样品 positive sample
经实验室标准分析方法或经典方法检出含有目标分析物的样品。
4 一般要求
4.1 酶联免疫试剂盒
酶联免疫试剂盒应包装完整；标签、标识应清晰、规范；应附使用说明书或等同的指导性文件，文
件内容应至少包括以下部分：
试剂盒名称；a）
应用范围：包括检测的目标物和适用的基质范围；b）
检测原理；c）
试剂盒的组成、储存条件及有效期；d）
试验所需自备的设备和试剂；e）
操作指南：包括溶液配制、样品制备、详细的检测步骤和结果计算；f）
注意事项：包括操作要点、安全提示、常见问题分析及解决。g）
4.2 实验室
实验室的生物安全管理应符合 GB 19489中相关要求。
4.3 检测指标
标准曲线、检出限、精密度、正确度和交叉反应率。
5 检测过程
5.1 检测样品的选择及制备
5.1.1 阴性样品和阳性样品应具有基质符合性，以及与实际样品所含除目标分析物外其他成分的相
似性。
5.1.2 阳性样品或阴性样品宜采用国家有证基体标准样品/标准物质、参考物质或者质量控制品等，若
不能获得，可自行制备，选择适宜的实验室标准分析方法或经典方法对样品中的目标分析物进行仪器测
定，确认所有阴性样品低于检出限，确认所有阳性样品中目标分析物的含量。
5.1.3 阳性样品、阴性样品及待测样品均按酶联免疫试剂盒说明书的步骤进行前处理。
5.2 试剂准备
将试剂盒从储存环境中取出，平衡至室温（23 ℃±2 ℃）后，按照酶联免疫试剂盒说明书进行
操作。
5.3 操作步骤
每个样品及标准溶液重复测定不少于 2次，按照酶联免疫试剂盒说明书中的步骤进行操作。
5.4 结果计算
5.4.1 标准曲线
标准曲线至少由 6个浓度组成，按照酶联免疫试剂盒说明书的程序操作，测定各浓度的吸光值取平
均值，绘制四参数拟合标准曲线或其他规定的标准曲线。对于准确定量的方法，线性回归方程的决定系
数 R²应不低于 0.99。
以校准品吸光度值为纵坐标，以校准品浓度为横坐标，进行四参数曲线拟合， 按式（1） 建立方
程，并计算相关系数。
y = d+
a d
1+
EC50
b （1）
式中：
y ─吸光度值；
d ─最小吸光度值；
a ─最大吸光度值，拟合曲线的上渐近线；
X ─校准品的浓度；
EC50 ─半数效应浓度；
b ─吸光度增加速率参数，即曲线在EC50处的斜率。
相关系数的计算：利用数据统计处理软件计算相关系数。
5.4.2 数据计算
通过标准曲线计算得到每个样本的测定浓度值。若样品吸光度值超出标准曲线范围，则先稀释至合
适倍数，重新进行检测，其分析结果为标准曲线计算获得的浓度乘以稀释倍数。
5.5 数据分析
5.5.1 检出限
重复测定空白样品或阴性样品不少于 20次，通过标准曲线计算得到对应浓度的平均值和标准偏差，
按式（2）计算定性检出限，按式（3）计算定量检出限。
LOD = x0+3s （2）
LOQ = x0+10s （3）
式中：
LOD ─定性检出限；
LOQ ─定量检出限；
x0 ─空白样品重复测定平均值；
s ─空白样品重复测定的标准偏差。
5.5.2 精密度
使用同一批次的试剂盒，选取低浓度、中浓度、高浓度 3个水平的阳性，每个浓度水平至少平行测
定 6次，计算得到批内变异系数。使用 3个不同批次的同一试剂盒，选取低浓度、中浓度、高浓度 3个
水平的阳性样品，每个浓度水平至少平行测定 3次，计算得到批间变异系数。方法工作范围内的精密度
评价参考 GB/T 32465，见附录 A。
按式（4）计算变异系数：
CV =
100％ （4）
式中：
CV ─变异系数；
s ─标准偏差；
x ─重复测定的平均值。
5.5.3 正确度
5.5.3.1 评价方法 1：与参比方法的比较
采用试剂盒与已知的国际或国家认可的参考方法对同一份样品至少测定 6次，按 GB/T 4889-2008中
F检验和 T检验进行评价，具体见附录 B。
5.5.3.2 评价方法 2：与有证基体标准物质的比较
（x对有证基体标准物质进行至少 6次平行测试，计算重复测定的平均值），按式（5）计算正
确度。
A =
100％ （5）
式中：
A ─正确度；
x ─重复测定的平均值；
D ─有证基体标准物质的认定值。
5.5.3.3 评价方法 3： 与添加样品的比较
选用试剂盒适用的每种样品基质，添加低浓度、中浓度、高浓度 3个水平的目标分析物，每个水平
至少测定 6次，按式（6）计算添加回收率。
R =
100％ （6）
式中：
R ─回收率；
x ─重复测定的平均值；
t ─添加样品的理论值。
5.5.4 交叉反应率
按照酶联免疫试剂盒说明书的程序操作，测定与目标分析物的结构类似物或功能类似物的交叉
反应。
将结构类似物或功能类似物稀释至系列浓度，按照 5.4.1得到相应的半数抑制浓度，按式（7）计算
交叉反应率。
CR =
EC50
EC′50
100％ （7）
式中：
CR ─交叉反应率；
EC50 ─目标分析物的半数效应浓度，根据标准曲线计算得到；
EC′50 ─结构类似物或功能类似物的半数效应浓度，根据标准曲线计算得到。
6 结果报告
结果报告应包含试剂盒产品的检测项目、具体检测样品信息及检测结果，检测结果应包含试剂盒的
检出限、精密度、正确度、交叉反应率等检测指标。
附 录 A
（资料性）
工作范围内精密度评价准则
A.1 实验室在校准曲线所确定的工作范围内研究精密度绝对值与目标组分浓度的关系。化学分析中，
一般情况下，精密度的绝对值与目标组分浓度或含量成线性关系，个别情况下，取对数或变换成相对标
准偏差后是一个常数。
A.2 可将使用 Horwitz 方程计算的结果用于评价精密度。表 A.1是用 Horwitz方程计算得到的不同浓度
或含量范围的再现性，可供实验室参考。
注：Horwitz 方程：CV=2（1-0.5lgw）。式中 w为质量分数，用 10的幂次指数表示 (例如：1 mg/kg=106)。
表 A.1 不同浓度或含量范围的再现性
质量分数
µg/kg
重复性CV
1 -a
10 -a
100 23
1 000 16
a 质量分数低于100 µg/kg时，Horwitz 方程给出的结果过高，不宜使用，此时只能使CV尽可能低。
A.3 在再现性条件下重复分析,变异系数 (CV)不超过 Horwitz 方程计算的结果。
A.4 在重复性条件下，变异系数通常为 Horvitz 方程计算的结果的 1/2 ~ 2/3。
A.5 不同浓度或含量的待测物精密度期望值见表 A.2,也可据此评价本实验室的精密度。
表 A.2 不同浓度或含量的待测物精密度期望值
目标组分含量/% 目标组分所占比率 相对标准偏差/%
100 1 1.3
10 10-1 1.9
1 10-2 2.7
0.1 10-3 3.7
0.01 10-4 5.3
0.001 10-5 7.3
0.000 1 10-6 11
0.000 01 10-7 15
0.000 001 10-8 21
0.000 000 1 10-9 30
附 录 B
（资料性）
与参比方法一致性评价
B.1 可按照 GB/T 4889-2008中 F检验和 T检验进行与参比方法一致性评价。先采用 F检验，考察
酶联免疫试剂盒与已知的国际或国家认可的参考方法所取得的两组数据的标准偏差是否一致；若一致，
再采用配对 T检验，考察两组数据的平均值是否存在显著性差异，若不存在显著性差异，说明两种方法
测定结构具有较好的一致性。
B.2 参考式（B.1）进行 F检验，考察两组检测数据的标准偏差是否一致，若一致按 B.3执行；若不一
致，则两组检测结果不一致。
F =
S......
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