路径: 主页 > MISC > 第239页 > LY/T 3107-2019 | 标准编号 | LY/T 3107-2019 (LY/T3107-2019) | | 中文名称 | 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 | | 英文名称 | Technical regulation for willow varieties identification by SSR markers | | 行业 | 林业行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B61 | | 国际标准分类 | 65.020.20 | | 字数估计 | 14,192 | | 发布日期 | 2019-10-23 | | 实施日期 | 2020-04-01 | | 发布机构 | 国家林业和草原局 | LY/T 3107-2019
(Identification of microsatellite markers for willow varieties)
ICS 65.020.20
B 61
LY
中 华 人 民 共 和 国 林 业 行 业 标 准
柳树品种微卫星标记鉴别技术规程
Technical regulation for willow varieties identification by SSR markers
2019 - 10 - 23发布
2020 - 04 - 01实施
国家林业和草原局 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。
本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC 115）提出并归口。
本标准主要起草单位：南京林业大学。
本标准参加起草单位：江苏省林业科学研究院；山东省林业科学研究院。
本标准主要起草人：李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。
柳树品种微卫星标记鉴别技术规程
范围
本标准规定了以柳属(Salix)植物 DNA 为材料，利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定
的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。
本标准适用于附录 A 中所列柳树品种的鉴别。
2 术语和定义
2.1 微卫星标记 microsatellite
微卫星标记，又被称为短串联重复序列(short tandem repeats, STRs)或简单重复序列(simple sequence
repeats，简称 SSR)，是指基因组中由 2～6 个核苷酸组成的 DNA 串联重复序列。
2.2 基因型频率 genotype frequency
基因型频率指不同基因型在全部个体中所占的比率，全部基因型频率的总和为 1 或 100%。
3 操作程序
3.1 取样和保存
取柳树幼嫩叶片 5 片～10 片，用干燥硅胶密封保存，用于 DNA 提取。
3.2 DNA 提取所需试剂
a) 1 M Tris：称取 12.11 g Tris 溶解到 80 mL 超纯水中，调节 pH=8.0，定容到 100 mL。
b) 0.5 M EDTA：称取 18.61 g EDTA 溶解到 80 mL 超纯水中，调节 pH=8.0，定容到 100 mL。
c) 5 M 氯化钠：称取 23.38 g 氯化钠溶解到 80 mL 超纯水中，定容到 100 mL。
d) 5 M 醋酸钾：称取 25.54 g 醋酸钾，200 mL 超纯水溶解后定容到 250 mL。
e) 2% SDS：称取 1.0 g 十二烷基硫酸钠(SDS)，40 mL 超纯水溶解后定容到 50 mL。
f) 10% CTAB：称取 10 g CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解到 80 mL 超纯水中，定容 到 100 mL。
g) 氯仿异戊醇：240 mL 氯仿，10 mL 异戊醇混合。
h) 70%乙醇：70 mL 乙醇，加入 30 mL 超纯水。
i) CTAB 裂解液：1 mL 1 M Tris(pH=8.0)，4 mL 0.5 M EDTA(pH=8.0)，28 mL 5 M 氯化钠，10 mL 10%
CTAB，5 g 聚乙烯吡咯烷酮，定容到 100 mL。
j) TBE 缓冲液(10×)：称取 108 g Tris 碱和 55 g 硼酸，加入 40 mL 0.5 M EDTA 溶液（pH=8.0），用
800 mL 双蒸水溶解后定容到 1 L，高温灭菌。
3.3 DNA 提取
DNA 提取采用改良的 CTAB 法：
a) 向 2 mL 离心管中加入 400 µL CTAB 裂解液，10 µL 的 10 mg/mL Rnase，2 µL β-巯基乙醇。
b) 取柳树叶片 3-5 片，放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入 3.2.1 的离 心管中，
涡旋混匀后，65℃保温 10 min，再加入 400 µL 2% SDS，涡旋混匀，65℃保温 10 min。
c) 向 3.2.2 的离心管中加入 130 µL 5 M 醋酸钾，涡旋混匀，将离心管插入冰中保存 10 min。
d) 加入 800 µL 氯仿异戊醇溶液(氯仿:异戊醇=24:1)，涡旋混匀后，12000 rpm 离心 5 min。
e) 将上清液转移到新的 2 mL 离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管 8-10 次，-20℃冻
存 20 min。
f) 取出离心管，12000 rpm 离心 5 min，去除上清液。
g) 加入 500 µL 的 70%乙醇，12000 rpm 离心 2 min，去除上清液。
h) 重复 3.2.7 步骤一次。
i) 加入 500 µL 无水乙醇，12000 rpm 离心 5 min，去除上清液，离心管开盖室温放置 30 min。
j) 加入 100 µL TE 缓冲液，37℃保存 5 min，涡旋混匀获得 DNA，将样品放在-80 ℃长期保存。
3.4 DNA 定量及质量检测
a) 取 2 µL DNA 用微量核酸蛋白检测仪检测，直接读出 DNA 浓度和 A260/280 的比值。
b) 根据上述测定浓度，取 200 ng DNA，加入 2 µL 溴酚蓝，在 1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入 5000
bp marker 作对照，稳压 100 V，电泳缓冲液为 1×TBE，电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。
c) 根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成 20 ng/µL，在-20℃下保存备用。
3.5 目的片段 PCR 扩增
3.5.1 16 对 SSR 引物及序列见附录 B。
3.5.2 目的片段扩增反应体系为 15 µL，具体试剂用量见表 1。
表 1 PCR 扩增反应体系
试剂 浓度 所需体积(µL)
PCR buffer 10×PCR buffer(Mg2+ Plus) 1.5
Taq 酶 5 U/µL 0.2
Forward Primer 5 mM 1
Revere Primer 5 mM 1
DNA 20 ng/µL 2
dNTP 5 mM 0.3
dUTP 250 nM 1
H2O 6.8
3.5.3 PCR 扩增反应
将配制的扩增体系加入到 8 连管或 96 孔 PCR 板中，盖上管盖后涡旋混匀，在 3000 rpm 下离心 5 s，
放入 PCR 仪中扩增，扩增程序为：
1) 94 ℃变性 4 min；
2) 94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 35 个循环；
3) 72 ℃延伸 10 min，15 ℃ 保存。
3.6 目的片段检测
3.6.1 PCR 产物变性
PCR 产物用双蒸水稀释 10-15 倍，取 1µL 稀释产物加入到 9 µL 的 Loading buffer (91%超纯甲酰胺，
9%内标 Genescan 500 Rox)后混匀；在 PCR 仪上运行变性程序：95℃变性 5 min，迅速放冰上冷却。
3.6.2 PCR 扩增产物检测
PCR 产物检测采用 ABI PRISM 3130xl 分析系统。从数据采集软件中创建一个片段分析程序，选择
片段分析模式以及光谱校正所用试剂盒类型。创建一个自动分析模板，填写分析样品名称，选择样品类
型、内标类型、分析方法等。将变性的产物转入 96 孔 PCR 板，盖上仪器自带的 PCR 板盖，放入仪器
中。在软件中将 PCR 板链接到仪器，点击开始进行基因型分型。
3.6.3 PCR 扩增产物条带分析
采用基因型分析软件打开基因型分型的结果，根据内参大小直接读出每个样品目的片段的大小。
4 送检样品分析
送检样品分析程序为：
a) 随机选取附录 B.1 中的一对 SSR 引物，对待检样品进行 PCR 扩增。
b) 将待检样品扩增得到的条带和附录 C.1-C.2 中对应引物的标准谱带相比较。
c) 如果所有扩增条带和附录 C.1-C.2 中对应引物某一品种的标准谱带完全相同，即判定为相同品
种；如果扩增条带和其中几个品种的条带完全相同，则增加一对引物进行检测，直至检测到唯
一匹配的品种。
d) 如果待检样品所有扩增条带有一个以上位点与标准谱带不同，即判定为不同品种。
e) 根据基因型频率判定所鉴定品种真实性的准确率，见附录D。
附录 A
（资料性附录）
本标准适用鉴定的柳树品种表
表 A.1 本标准适用鉴定的柳树品种
序号 品种中文名 拉丁名
1 苏柳 172 Salix jiangsuensis CL ‘J172’
2 苏柳 485 S.jiangsuensis CL ‘485’
3 苏柳 52-2 S.jiangsuensis CL ‘52-2’
4 苏柳 795 S.jiangsuensis CL ‘J795’
5 苏柳 799 S.jiangsuensis CL ‘J799’
6 苏柳 J932 S.jiangsuensis CL ‘J932’
7 簸杞柳 JW9-6 S.integra × S.suchowensis ‘JW9-6’
8 簸杞柳 JW8-26 S.suchowensis × S.integra ‘JW8-26’
9 “旱沙王”北沙柳 S.psammophila ‘Hanshawang’
10 银芽柳 J1037 S.agyrobractealis ‘J1037’
11 银芽柳 J1050 S.agyrobractealis ‘J1050’
12 银芽柳 J1055 S.agyrobractealis ‘J1055’
13 银芽柳 J887 S.agyrobractealis ‘J887’
14 金丝垂柳 J1010 S.aureo-pendula ‘J1010’
15 金丝垂柳 J1011 S.aureo-pendula ‘J1011’
16 花叶柳 S.integra var.‘Hakuro Nishiki’
17 渤海柳 1 号 S.matsudana Koidz ‘Bohailiu-1’
18 渤海柳 2 号 S.matsudana Koidz ‘Bohailiu-2’
19 渤海柳 3 号 S.matsudana Koidz ‘Bohailiu-3’
20 渤海柳 4 号 S.matsudana Koidz ‘Bohailiu-4’
21 旱柳 S.matsudana Koidz
22 沙柳 S.psammophila
23 黄柳 S.gordejevii Chang et SkV.
附录 B
（规范性附录）
柳树品种鉴别 16 对 SSR 引物序列
表 B.1 柳树品种鉴别的 16 对 SSR 引物
序号 引物名称 引物正向序列(5’-3’) 引物反向序列(5’-3’)
3 W64-41 TCAGAGCCTGGTTCATAA ACAAATGCCAGAGCTAAA
4 W64-65 GCATACTTGGGCGTTGAT TGACTTGGGTTGGGTTTT
5 W64-255 GTCTGAACCCTCATCTAT CTGGAATCCATAATACAC
6 W64-272 TCACTTGCCGCCCTTCTT TGACGCCGCTGTAACCAC
8 W64-293 GCAAAAGCCAAAAGGAGA AACCAGCAGAGGAAAGTG
9 W64-311 AGAGCAAAGCACATTTCA ATACATCTACTGCCACCC
10 W253-12 ATCAAATCACGCTAATCC AACAAGAAAGCAACATCG
11 W253-17 ATTGAATGGGCACTAACC GCACTTCCACCTACCTCC
12 W253-38 CCCACCAAAGCGTCTGTC CGAGTTGTTGGGCTGGAT
13 W253-47 TTATTGCTGGAAAGGTTG TTCGTGTCTTTAGGGTCT
14 W-292-5 AAAGAAGGCAAACAAAGCA AAACAGCGAAAGAAGCAAA
16 W-265-23 TGGGAGGAGTGTCAGAAG CTCCATAACAACCAGCAA
附录 C
（资料性附录）
16 对引物鉴定柳树品种指纹图谱表
表 C.1 引物 W254-1、W46-460、W64-41、W64-65 、W64-255、W64-272、W64-286 和 W64-293 鉴定柳树品种指纹图谱表
品 种
引 物
W254-1 W46-460 W64-41 W64-65 W64-255 W64-272 W64-286 W64-293
苏柳 172 389 457 469 155 167 251 285 222 228 244 258 223 153 220 224 253 258 277 255 264
苏柳 485 380 390 463 251 286 277 224 224 254 258 282 243 254
苏柳 52-2 390 398 465 472 155 167 170 222 221 225 188 270 254 257
苏柳 795 343 390 457 472 155 167 275 128 228 191 226 220 224 284 255
苏柳 799 342 390 457 472 251 285 128 222 228 244 220 223 220 224 277 255
苏柳 J932 343 389 457 463 155 167 212 257 128 224 224 277 282 292 255
簸杞柳 JW9-6 380 398 457 472 251 285 222 220 223 188 220 270 298 257 264
簸杞柳 JW8-26 398 465 167 232 319 221 225 188 267 242 254
“旱沙王”北沙柳 343 393 456 155 167 128 235 277 381 224 220 224 270 247 257
银芽柳 J1037 401 456 465 155 167 251 319 220 223 188 222 307 319 266
银芽柳 J1050 398 456 475 155 167 228 251 220 223 188 258 262 242 266
银芽柳 J1055 401 456 465 155 167 277 361 224 188 307 319 266
银芽柳 J887 380 398 459 167 222 277 221 225 188 220 270 299 239 266
金丝垂柳 J1010 343 393 457 463 470 155 167 275 285 128 222 235 191 226 159 220 224 284 247 257
金丝垂柳 J1011 343 393 457 155 167 251 285 128 222 235 223 220 224 270 285 247 257
花叶柳 390 398 457 167 222 319 220 223 188 220 291 243 264
渤海柳 1 号 343 389 457 469 155 212 228 232 257 262 224 153 200 224 277 282 255
渤海柳 2 号 389 459 467 155 235 361 381 368 224 200 254 258 262 243 257
渤海柳 3 号 390 456 465 469 155 159 167 228 236 381 224 220 254 258 277 255 264
渤海柳 4 号 343 393 456 469 155 167 212 228 236 381 224 200 220 224 258 277 247 257
旱柳 390 459 466 167 128 166 277 381 224 256 200 258 282 245 264 278
沙柳 379 393 395 467 212 239 257 285 162 170 228 319 218 224 222 286 294 250 257
黄柳 381 389 159 167 212 257 128 381 224 224 251 271 277 301 241 255
表 C.2 引物 W64-311、W253-12、W253-17、W253-38、W253-47、W292-5、W253-22 和 W265-23 鉴定柳树品种指纹图谱表
品 种
引 物
W64-311 W253-12 W253-17 W253-38 W253-47 W292-5 W253-22 W265-23
苏柳 172 158 176 241 255 222 232 202 213 237 242 227 174 188 287 321 349 270 288
苏柳 485 158 176 241 191 232 202 213 234 227 231 174 179 271 289 264 288
苏柳 52-2 170 241 195 235 227 237 174 176 271 289 288 293
苏柳 795 158 183 241 255 222 213 237 225 174 179 188 253 287 321 270 288 303
苏柳 799 158 180 241 255 222 232 213 237 225 174 188 321 270
苏柳 J932 158 176 196 241 199 218 232 202 213 237 242 227 231 169 174 188 321 244 263
簸杞柳 JW9-6 164 170 241 204 235 227 233 174 176 253 287 288 293
簸杞柳 JW8-26 180 241 194 202 240 225 237 174 321 288 293
“旱沙王”北沙柳 176 241 255 184 222 232 202 213 237 242 227 174 188 321 349 270 288 297
银芽柳 J1037 164 243 253 189 194 240 237 243 170 174 320 357 291
银芽柳 J1050 180 243 251 189 194 240 230 237 170 174 320 357 291
银芽柳 J1055 160 164 243 251 189 240 237 243 170 174 320 357 291
银芽柳 J887 160 181 241 202 240 233 170 174 321 288 297
金丝垂柳 J1010 176 183 241 255 222 202 213 237 242 225 174 179 188 253 287 270
金丝垂柳 J1011 176 183 241 255 222 202 213 237 242 225 174 179 188 253 287 270 288
花叶柳 164 241 204 240 233 246 174 182 321 288 293
渤海柳 1 号 158 183 241 251 255 188 230 213 237 227 170 174 179 188 321 270 288 297
渤海柳 2 号 176 183 243 251 190 220 232 202 213 237 242 227 170 174 179 321 270 288 297
渤海柳 3 号 176 241 255 188 211 230 202 213 237 242 227 174 188 321 270 288 297
渤海柳 4 号 183 241 255 188 230 213 237 227 174 188 321 270 288 297
旱柳 158 176 203 241 189 201 232 202 213 237 242 227 174 321 288 297
沙柳 172 203 223 243 251 198 242 227 233 174 176 307 321 267 291
黄柳 158 180 189 241 191 232 202 213 237 242 227 174 321 288
附录 D
（资料性附录）
各引物鉴定柳树品种基因型频率表
表 D.1 各引物鉴定柳树品种基因型频率表
品种名称
引 物 16 个位点
基因型相
同概率
W254-1 W46-460 W64-41 W64-65 W64-255 W64-272 W64-286 W64-293 W64-311 W253-12 W253-17 W253-38 W253-47 W292-5 W253-22 W265-23
1 苏柳 172 0.08 0.08 0.08 0.04 0.08 0.04 0.04 0.08 0.08 0.36 0.08 0.36 0.36 0.24 0.04 0.08 4.81E-17
2 苏柳 485 0.04 0.04 0.04 0.04 0.08 0.08 0.04 0.04 0.08 0.36 0.08 0.04 0.08 0.04 0.08 0.04 2.47E-20
3 苏柳 52-2 0.08 0.04 0.28 0.04 0.12 0.2 0.12 0.04 0.04 0.36 0.04 0.08 0.04 0.12 0.08 0.16 1.17E-17
4 苏柳 795 0.04 0.12 0.04 0.04 0.08 0.2 0.08 0.16 0.08 0.36 0.12 0.16 0.16 0.12 0.04 0.04 2.67E-17
5 苏柳 799 0.04 0.12 0.08 0.04 0.24 0.2 0.04 0.16 0.04 0.36 0.08 0.16 0.16 0.24 0.44 0.08 1.18E-15
6 苏柳 J932 0.08 0.04 0.04 0.04 0.32 0.08 0.04 0.16 0.04 0.36 0.04 0.36 0.08 0.04 0.44 0.04 9.80E-18
7 簸杞柳 JW9-6 0.08 0.12 0.08 0.04 0.24 0.12 0.04 0.2 0.04 0.36 0.08 0.08 0.08 0.12 0.12 0.16 1.20E-16
8 簸杞柳 JW8-26 0.12 0.04 0.16 0.04 0.12 0.2 0.04 0.04 0.12 0.36 0.04 0.28 0.04 0.12 0.44 0.16 1.93E-16
9 ‘旱沙王’北沙柳 0.2 0.08 0.28 0.08 0.32 0.2 0.04 0.2 0.12 0.36 0.08 0.36 0.36 0.24 0.08 0.24 3.79E-13
10 银芽柳 J1037 0.08 0.08 0.28 0.04 0.24 0.04 0.08 0.08 0.08 0.04 0.12 0.28 0.08 0.2 0.16 0.16 1.94E-16
11 银芽柳 J1050 0.12 0.08 0.28 0.08 0.24 0.2 0.08 0.08 0.12 0.2 0.12 0.28 0.08 0.2 0.16 0.16 2.18E-14
12 银芽柳 J1055 0.08 0.08 0.28 0.04 0.08 0.2 0.08 0.08 0.04 0.2 0.04 0.28 0.08 0.2 0.16 0.16 2.69E-16
13 银芽柳 J887 0.08 0.04 0.16 0.04 0.12 0.12 0.04 0.04 0.04 0.36 0.04 0.28 0.04 0.2 0.44 0.08 2.14E-17
14 金丝垂柳 J1010 0.2 0.04 0.04 0.......
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