路径: 主页 > SN/T > 第62页 > SN/T 1162-2020 | 标准编号 | SN/T 1162-2020 (SN/T1162-2020) | | 中文名称 | 传染性胰脏坏死病检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical specifications for quarantine of infectious pancreatic necrosis) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 13,189 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 旧标准 (被替代) | SN/T 1162-2002 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 1162-2020: 传染性胰脏坏死病检疫技术规范
SN/T 1162-2020 英文名称: (Technical specifications for quarantine of infectious pancreatic necrosis)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
代替 SN/T 1162-2002
传染性胰脏坏死病检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本文件按照 GB/T 1.1-2020 的规定起草。
本文件代替 SN/T 1162-2002《传染性胰脏坏死病毒（IPNV）酶链免疫吸附试验（ELISA）诊断
方法》。
本文件与 SN/T 1162-2002 相比，主要技术变化如下：
--增加了临床症状的描述；
--增加了 SYBR Green 荧光 RT-PCR 方法；
--增加了 RT-PCR 方法；
--修改了综合判定。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院。
本文件主要起草人：刘荭、郑晓聪、刘莹、王津津、贾鹏、温智清、何俊强、于力、史秀杰、
兰文升、王红英、叶奕优。
本文件所代替文件的历次版本发布情况为：
-- SN/T 1162-2002。
传染性胰脏坏死病检疫技术规范
1 范围
本文件规定了传染性胰脏坏死病毒的分离、SYBR Green 实时荧光逆转录聚合酶链式反应、逆转
录聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验的检测方法。
本文件适用于传染性胰脏坏死病的流行病学监测、检测与检疫。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088 出入境动物检疫采样
4 概述
传 染 性 胰 脏 坏 死 病（infectious pancreatic necrosis, IPN） 是 由 传 染 性 胰 脏 坏 死 病 毒（infectious
pancreatic necrosis virus, IPNV）引起的一种危害极其严重的传染性、病毒性鱼类疾病，主要流行于鲑
科鱼类的鱼苗和幼鱼（参见附录 A）。
5 试剂和材料
5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。
5.2 DEPC 水：配制方法见附录 B 中 B.1 或购买商品化试剂。
5.3 IPNV 参考株。
5.4 细胞系：CHSE-214、RTG-2 或 BF-2 细胞系。
5.5 HEPES ：4- 羟乙基哌嗪乙磺酸。
5.6 兔抗 IPNV 参考抗血清。
5.7 羊抗 IPNV 抗体。
5.8 酶标羊抗兔 IgG ：按照说明书使用。
5.9 引物：用 DEPC 水将每条引物配制成 100 μmol/L 储存液，置-20 ℃以下冻存；使用时，取适量配
制成 20 μmol/L 工作液，避免多次冻融。具体序列如下：
用于 SYBR Green 实时荧光 RT-PCR，扩增 IPNV VP2 基因中 122 bp 的片段。
用于 RT-PCR，扩增 IPNV NS 与 VP3 基因之间 174 bp 的片段。
6 器材和设备
6.1 酶标测定仪。
6.2 倒置显微镜。
6.3 恒温培养箱。
6.4 PCR 扩增仪。
6.5 凝胶成像仪。
7 IPNV 的分离与鉴定
7.1 采样
取样数量按照 GB/T 18088 的规定执行。有临床症状的鱼，体长小于等于 4 cm 的鱼苗取整条，若
是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长 4 cm~6 cm 的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于 6 cm 的鱼则取肝、
肾和脾。无临床症状的鱼取肝、肾和脾；成熟的雌鱼还需取卵巢液。鱼卵则取卵壳。
7.2 样品处理
应保持在 10 ℃以下进行处理。先用组织研磨器将样品匀浆，再按 1∶10 的最终稀释度悬浮于细
胞培养液（见附录 B 中 B.2）中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须在细胞培养液中加入
1 000 IU/mL 青霉素和 1 000 μg/mL 链霉素。于 15 ℃下孵育 2 h ~4 h 或 4 ℃下孵育 6 h ~24 h。7 000 r/min
离心 15 min，收集上清液。卵巢液不必匀浆，稀释 2 倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后
的步骤中直接用其上清液。
7.3 病毒分离
对 1: 10 的组织匀浆上清液用细胞培养液再做两次 10 倍稀释，然后将 1: 10、1: 100、1: 1 000 3 个
稀释度的上清液，用无菌操作方法，以适当的体积分别接种到生长约 24 h 的 CHSE-214、RTG-2 或
BF-2 细胞单层中，每孔（2 cm2）的细胞单层最多接种 100 μL 稀释液。15 ℃ ~20 ℃吸附 0.5 h ~1 h 后，
加入细胞培养液。置于 18 ℃ ±2 ℃培养。
阳性对照组和待测样品都接种细胞后，7 d 内每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。
如果除阳性对照细胞外，被检匀浆上清稀释液的细胞培养中没有细胞病变（CPE）出现，则在培养 7
d 后还要用敏感细胞再进行传代培养。传代时，冻融并收集接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培
养物，以 7 000 r/min 4 ℃离心 15 min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养 7 d，每天
镜检。如果盲传后没有 CPE 出现，则结果判为阴性。
如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养或者盲传后的细胞培养中出现 CPE，应立即应用
SYBR Green 实时荧光 RT-PCR、常规 RT-PCR 或 ELISA 等方法进行 IPNV 鉴定。CPE 表现为局部区
域细胞开始裂解，周围细胞收缩变圆，逐渐发展，细胞最终全部脱落。
如果阳性对照也未出现 CPE，则试验无效，必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新按上述方
法进行病毒学检查。
7.4 IPNV 的 SYBR Green 实时荧光 RT-PCR 检测
7.4.1 设立对照
每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照
为不含 IPNV 的组织或细胞培养物；阳性对照为含 IPNV 的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的
RNA。
7.4.2 RNA 抽提
分别取 200 μL 待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物，加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器
充分吹打 10 次～20 次，室温放置 5 min ；加入 200 μL 三氯甲烷，旋涡振荡 30 s 混匀，室温放置
15 min ；12 000 r/min 离心 10 min ；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数
次混匀，-20 ℃放置 20 min ；12 000 r/min 离心 10 min ；弃上清液，沉淀用 1 mL 75％乙醇清洗；
8 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，沉淀室温干燥 5 min ；加 20 μL DEPC 水溶解 RNA 沉淀。4 ℃冰
箱保存备用，RNA 溶液应避免反复冻融，并尽快用于检测。
RNA 提取也可采用等效的商品化 RNA 提取试剂盒，代替以上方法。
7.4.3 反应体系
在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 1 配制反应体系， 加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳
性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。
7.4.4 分析条件设定
以综合分析仪器给出的各项结果、基线（baseline）以及仪器给出的默认值作为参考，阈值设定
以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为原则，具体还需根据仪器噪音情况进行调
整；选择 SYBR 通道进行分析。
SYBR Green 实时荧光 RT-PCR 产物的特异性可用溶解曲线分析来确定。当扩增反应结束后，直
接在荧光 PCR 仪上运行 melting allias 程序进行溶解曲线分析。程序的反应步骤：95 ℃ 15 s；58 ℃ 20 s，
在 20 min 内温度上升至 95 ℃并维持 15 s。
7.4.5 结果判定
阳性对照 Ct 值小于或等于 30，有典型的扩增曲线，溶解曲线有明显的溶解温度；阴性对照和空
白对照无 Ct 值或 Ct 值大于 35，无扩增曲线，溶解曲线无明显的溶解温度，结果成立。
待测样品 Ct 值小于或等于 30，且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阳性。
待测样品呈现无 Ct 值、无扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阴性。
对于 Ct 值大于 30、小于 40 的样品，应重新调整模板浓度后重复实验。重复检测样品 Ct 值小于
或等于 30 且扩增曲线有明显的对数增长期，判为荧光 RT-PCR 结果阳性，否则判为荧光 RT-PCR 阴
性反应。
7.5 IPNV 的 RT-PCR 检测
7.5.1 设立对照
每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 DEPC 水代替样品；阴性对照
为不含 IPNV 的组织或细胞培养物；阳性对照为含 IPNV 的阳性组织、细胞培养物或含目的片段的
RNA。
7.5.2 RNA 抽提
分别取 200 μL 待检样品组织上清液或待检样品细胞培养物，加入 1 mL Trizol 试剂，用移液器充分
吹打 10 次～20 次，室温放置 5 min ；加入 200 μL 三氯甲烷，旋涡振荡 30 s 混匀，室温放置 15 min ；
12 000 r/min 离心 10 min；取上层水相至一新的离心管中，加等体积异丙醇，上下颠倒数次混匀，-20 ℃
放置 20 min ；12 000 r/min 离心 10 min ；弃上清液，沉淀用 1 mL 75％乙醇清洗；8 000 r/min 离心
7.5.3 反应体系
在 0.2 mL PCR 反应管中，按表 2 配制反应体系， 加样宜按空白对照、阴性对照、待检样品、阳
性对照的次序分别加入模板，盖上管盖，充分混匀。
7.5.4 电泳检测
用新鲜配制的 1×TAE 电泳缓冲液配制 2 % 琼脂糖凝胶，采用 Goldview 或其他等效核酸染料，按
说明书使用。取适量扩增产物液进行电泳检测，设 DNA Marker 同步电泳；采用 5 V/cm～8 V/cm，电
泳 1 h，用凝胶成像仪或紫外透射仪观察，拍照记录检测结果。
7.5.5 结果判定
在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。阴性对照、空白对照应无特异扩增产
物，阳性对照应有分子量为 174 bp 的特异扩增产物。否则，本次实验无效。
在对照成立的条件下，如果待检样品出现分子量为 174 bp 的特异扩增产物，判为 RT-PCR 检测
阳性；如果没有出现特异扩增条带，判为 RT-PCR 检测阴性。
7.5.6 RT-PCR 检测结果的确证
将 RT-PCR 阳性扩增产物克隆后测序，将所测得的扩增产物序列与 GenBank 收录的 IPNV 序列进
行比较，序列吻合的表明确证为阳性，参考序列参见附录 C。
7.6 IPNV 的 ELISA 检测
7.6.1 包被和封闭
将羊抗 IPNV 抗体用包被液（见附录 B 中 B.3）做适当稀释后包被酶标板，每孔 100 μL，4 ℃孵
育 12 h～24 h 或者 37 ℃反应 1.5 h～2 h。倒出孔内液体，将 PBST （见附录 B 中 B.4）加满小孔，2 min
后倒出，拍干。如此重复 3 次。用封闭液（见附录 B 中 B.5）封闭，每孔 200 μL，37℃反应 1 h。弃
去封闭液，用 PBST 洗 1 次，拍干后可现用，也可以密封后在-20 ℃保存 2～3 个月。
7.6.2 加样
每个样品两孔，每孔 100 μL。另将含有 IPNV 参考毒株的细胞培养液（阳性对照）、含有其他病
毒的细胞培养液（阴性对照）和细胞培养液（空白对照）也各加两孔。37 ℃反应 1.5 h～2 h。倒出孔
内液体，用 PBST 洗 3 次。
7.6.3 加入抗 IPNV 的抗血清
每孔加 100 μL 稀释到工作浓度的兔抗 IPNV 参考抗血清（用细胞培养液稀释），37 ℃反应 1.5 h～2 h。
倒出孔内液体，用 PBST 洗 2 次。
7.6.4 去除非特异性的过氧化物酶
每孔加 0.1 μL 0.1% 的 H2O2（用双蒸水稀释）。37 ℃ 反应 15 min 以去除非特异性的过氧化物酶。
倒出孔内液体，用 PBST 洗 2 次。
7.6.5 加酶标二抗
每孔加 100 μL 稀释到工作浓度的酶标羊抗兔 IgG（用细胞培养液稀释），37 ℃反应 1.5 h～2 h。
倒出孔内液体，用 PBST 洗 3 次。
7.6.6 加底物显色
每孔加 100 μL OPD 溶液（见附录 B 中 B.6），室温避光反应 10 min。
7.6.7 终止反应
当阳性对......
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