路径: 主页 > SN/T > 第62页 > SN/T 2985-2020 | 标准编号 | SN/T 2985-2020 (SN/T2985-2020) | | 中文名称 | 马流行性感冒检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical Specifications for Equine Influenza Quarantine) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 13,14 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 旧标准 (被替代) | SN/T 2985-2011 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 2985-2020: 马流行性感冒检疫技术规范
SN/T 2985-2020 英文名称: (Technical Specifications for Equine Influenza Quarantine)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
代替 SN/T 2985-2011
马流行性感冒检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
1 范围
本文件规定了马流行性感冒的临床诊断和实验室诊断。
本文件适用于进出境马流感的检疫。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 19489 实验室 生物安全通用要求
SN/T 1687 马流感血凝抑制试验操作规程
4 临床诊断
4.1 临床症状
马 流 行 性 感 冒 是 由 正 黏 病 毒 科 A 型 流 感 病 毒 属 中 两 个 抗 原 性 不 同 的 A 型 流 感 病 毒 亚 型
（H7N7，称为马 -1 型；H3N8，称为马 -2 型）所引起的一种急性呼吸道疾病。易感马发病时，
临床症状表现为发热，发出刺耳的干咳，鼻流黏性脓性分泌物；有一定免疫力马发病时，上述症
状可能不会全部表现出来。
4.2 病理变化
4.2.1 病理解剖变化
眼观病变为结膜潮红、水肿、外翻，呈砖红色或淡黄色，常出现角膜浑浊。上呼吸道黏膜充
血、水肿和渗出，上皮细胞脱落与局灶性糜烂。头、颈部淋巴结肿大。肺脏充血、水肿，扩张不
全。肝脏一般无明显眼观病变。
4.2.2 病理组织学变化
表现为急性支气管炎与细支气管炎，以管腔内有多量嗜中性粒细胞渗出为主要特征。炎症一
过性，一般只见于发病后的头 4 d，其后炎症消退，黏膜内遗留有轻度淋巴细胞，浆细胞浸润。
严重的病例为急性支气管间质性肺炎，表现为肺泡纵膈普遍增厚，增生的细胞为组织细胞与淋巴
细胞。肝脏可发现肝窦状隙内有弥散性或结节性淋巴细胞、组织细胞浸润。
4.3 流行病学
自然条件下，只有马属动物易感，没有年龄、性别和品种差别。病马咳嗽喷出含有病毒的飞
沫，经呼吸道传染是本病主要的传播方式。实验证明，此病可通过空气传播，也可通过污染的饲
料、饮水经口传染。病毒在康复马匹的精液中存在很久，因此性交也是此病的一种重要传播方式。
本病传播极为迅速，引进易感畜群，呈爆发性流行，经 1 周或稍多些时间，所有易感马都感染发
病。本病一年四季均可发生，我国北方地区以春秋多发。有些地区则多发生于冬末春初，而另一
些地区则流行于夏季。
5 实验室诊断
5.1 病原分离鉴定
5.1.1 实验室生物安全要求
马流感病毒病原分离鉴定应在生物安全 2 级实验室或相应级别的生物安全柜中进行，实验室
条件应符合 GB 19489 要求。
5.1.2 设备、材料和试剂
5.1.2.1 设备
高速台式冷冻离心机、台式离心机、旋涡振荡器、冰箱（4℃ 和-20℃）、高压灭菌锅、酶标仪、
荧光 PCR 仪、PCR 反应管或反应板、倒置显微镜、微量可调移液器（10 μL、200 μL、1 000 μL）。
5.1.2.2 材料和试剂
5.1.2.1 采样用：棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5 mL 离心管、研钵，采样工具应经 121℃±2℃、
15 min 高压灭菌并烘干，pH 7.2、0.01 mol/L PBS，配制方法见附录 A，抗生素（青霉素和链霉素）。
5.1.2.2 鸡胚接种用：照蛋器、打孔器、酒精灯，5% 碘酊，70% 酒精，1.0 mL 一次性灭菌注射
器，石蜡，9~11 日龄 SPF 鸡胚。
5.1.2.3 尿囊液活性测定用：96 孔 V 型微量反应板，振荡器，微量加样器，阿氏液，鸡红细胞悬
液，配制方法见附录 B。
5.1.2.4 细胞接种用：犬肾细胞，新生犊牛血清，细胞培养瓶，MEM 培养液，配制方法见附录 C。
5.1.2.5 病毒抗原 ELISA 检测用：ELISA 检测试剂盒。
5.1.2.6 荧光 RT-PCR 用：TriZol 或其他病毒 RNA 提取试剂盒，反转录磁珠（RT-PCR Ready-To-
GoTM beads），Taq DNA 聚合酶，三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇（分析纯）。
5.1.3 采样、送样和处理
5.1.3.1 在临床症状出现后立即采取样品，样品包括鼻咽拭子或鼻、气管冲洗物。
5.1.3.2 拭子是用缠在金属丝上的吸水棉或纱布做成。取样时将鼻咽拭子经前侧鼻道送入鼻咽部
并停留大约 1 min，粘取呼吸道黏液，取出后立即放入盛有运输培养液的小瓶中。鼻、气管冲洗
物通过鼻内窥镜检查采取。
5.1.3.3 运输培养液是含有 40% 甘油的 PBS，或是含有 2% 胰蛋白酶的磷酸盐肉汤﹝加 2% 抗生
素溶液（青霉素和链霉素各 10 000 IU/100 mL）和两性霉素 B（250 mg/mL 母液）﹞。
5.1.3.4 如果样品在 1 d~2 d 内接种，则 4℃ 保存即可；如果要长时间保存，则应在 -70℃ 或更
低温度保存，运送样品也应冷藏运输。
5.1.3.5 将液体通过挤压从鼻咽拭子挤出，1 500 g 离心 15 min，取上清液使用。剩余液体放
在 -70℃ 或更低温度保存。
5.1.4 鸡胚病毒分离
5.1.4.1 将 9~11 日龄 SPF 鸡胚放在照蛋器上照视检查，并用铅笔画出气室与胚胎位置，在气室
边缘上 2 mm~8 mm 处避开血管作一标记，并在鸡胚绒毛尿囊膜血管相对较少一侧气室作标记。
5.1.4.2 将鸡胚竖放在蛋座上，钝端向上。用 5% 碘酊消毒蛋壳气室后，用 70% 酒精脱碘消毒，
用无菌处理的打孔器在标记处钻一小孔，勿损伤壳膜。
5.1.4.3 用 1.0 mL 注射器吸取 0.2 mL 处理好的样品，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜注入尿囊腔。
每个样品接种 5 个鸡胚。
5.1.4.4 接种后，石蜡熔化封孔，于 34℃~35℃ 孵化箱内继续孵育 3 d。接种后 24 h 内死亡的鸡
胚弃去。
5.1.4.5 将接种 24 h 后死亡和 3 d 内仍然存活的鸡胚转移到 4℃ 冰箱中 4 h 或过夜，使鸡胚死亡，
无菌收取尿囊液。
5.1.5 尿囊液血凝性测定
5.1.5.1 操作步骤
5.1.5.1.1 在微量反应板的 1~12 孔内加入 PBS，每孔 0.025 mL。
5.1.5.1.2 再吸取按 5.1.4.5 步骤收集的鸡胚尿囊液 0.025 mL（尿囊液病毒抗原处理方法见 SN/T
1687-2005）加入第 1 孔，混匀。
5.1.5.1.3 从第 1 孔吸取 0.025 mL 液体加入第 2 孔，混匀后吸取 0.025 mL 液体加入第 3 孔，如
此倍比稀释至第 12 孔，吸弃 0.025 mL。
5.1.5.1.4 每孔再加入 0.025 mL PBS。
5.1.5.1.5 每孔再加入 0.025 mL 1% 的鸡红细胞悬液，加之前，红细胞悬液要充分摇匀。
5.1.5.1.6 轻轻振荡混匀，在 20℃~25℃ 下静置 40 min 后观察结果，也可于 4℃ 下静置 60 min
后观察结果。
5.1.5.2 结果判定
当红细胞被凝集时，红细胞均匀分布在反应板底部，反应板倾斜片刻不下滑；红细胞未被凝
集时，反应板倾斜片刻，可见沉淀的红细胞向下滑动，形成流线。出现凝集的最高稀释倍数的倒
数为 HA 滴度。判定如下：
a） 样品无血凝活性：红细胞没有出现凝集时，则需将各样品尿囊液收集在一起，再经鸡胚
盲传，当传至第 5 代仍未出现血凝活性，判为马流感病毒阴性；
b） 样品有血凝活性：将所有血凝试验阳性的样品做小量等份分装保存备用，取一份测 HA
滴度。HA 滴度大于或等于 1/16 时，判为马流感病毒阳性；滴度较低时，要继续传代，
共盲传 5 代，HA 滴度仍低于 1/16 时，判为马流感病毒阴性。
5.1.6 细胞培养病毒分离
5.1.6.1 操作步骤
5.1.6.1.1 待犬肾细胞（MDCK）在细胞培养瓶中长成单层后，单层细胞用含 2 μg/mL 胰蛋白酶的
组织培养液（无血清）至少洗涤 2 次。
5.1.6.1.2 每孔加入 0.25 mL~0.5 mL 接种液，设三个重复，37℃ 二氧化碳培养箱中孵育 1 h。
5.1.6.1.3 再加入无血清含胰蛋白酶 0.5 μg/mL~2 μg/mL 培养液，置 37℃ 二氧化碳培养箱培养。
5.1.6.1.4 每天在显微镜下观察、记录细胞病变情况。
5.1.6.2 结果判定
培养 48 h~96 h 后，细胞肿胀变圆，聚团，最后崩解，则为细胞病变。
出现细胞病变或者培养 7 d 后，收集上清液按照 5.1.5.7 进行 HA 测试。HA 滴度大于或等
于 1/16 的判为阳性；无细胞病变和 HA 滴度小于 1/16 的继续传代培养，至少 5 代。
5.1.7 病毒抗原 ELISA 检测
5.1.7.1 操作步骤
5.1.7.1.1 将 100 μL 鼻咽拭子的浸出物加到用多克隆兔抗 H3N8 亚型血清包被的微量反应板各孔
内，在 22℃±2℃ 孵育 90 min，微量反应板用含 0.05% 吐温-20℃ 的 PBS 液（PBST）洗涤 3 次。
5.1.7.1.2 加 100 μL 已用缓冲稀释液做 1: 50 稀释的辣根过氧化物酶 - 单克隆抗体（MAb）结合物，
37℃ 温箱孵育 1 h，用 PBST 洗涤微量反应板 6 次。
5.1.7.1.3 加 100 μL 四甲基联苯胺溶液于微量反应板各孔中，22℃±2℃ 孵育 10 min，然后加 100 μL
0.18 moL/L 硫酸终止反应。使用酶标仪在 450 nm 波长处测定 OD 值。
5.1.7.2 结果判定
按试剂盒说明书，对测定结果进行判定。
5.1.8 H3N8 亚型马流感病毒荧光 RT-PCR 检测方法
5.1.8.1 阳性对照
马流感病毒 RNA 或者体外转录的非感染性 RNA 片段。
5.1.8.2 阴性对照
马流感病毒阴性组织样品。
5.1.8.4 病毒核酸的提取
5.1.8.4.1 向加有 600 μL 裂解液的灭菌离心管中加入待测样本 200 μL，用吸头反复吸打混匀。
5.1.8.4.2 再加入 200 μL 三氯甲烷，在混匀器上振荡混匀 5 s 或颠倒混匀 15 次（不宜过于强烈，
以免产生乳化层；离心（12 000 g，15 min）。
5.1.8.4.3 另取灭菌离心管，加入 600 μL 异丙醇（-20℃ 预冷），并加入上述离心后的上层液相
（注意不要吸出中间层，该层富含 DNA 和蛋白质），颠倒混匀。
5.1.8.4.4 离心（12 000 g，15 min）；轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体。
5.1.8.4.5 加入 600 uL 75% 乙醇（-20℃ 预冷），颠倒洗涤；离心（12 000 g，10 min）。
5.1.8.4.6 轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量吸干液体；离心 5 s，将管底部少量液体用微量
可调移液器吸干。
5.1.8.4.7 室温干燥 5 min ；于干燥后的沉淀中加入 30 μL DEPC 处理水，轻轻混匀，溶解管壁上
的 RNA（即为所需 RNA）。
5.1.8.5 荧光 RT-PCR 检测
5.1.8.5.1 荧光 RT-PCR 反应体系
见表 1。
5.1.8.5.2 荧光 RT-PCR 反应条件
将加入反应液的 PCR 管 5 000 r/min 离心 30 s，按照下列条件进行反应：反应参数为 42℃ 30 min ；
94℃ 3 min ；92℃ 10 s，45℃ 30 s，72℃ 60 s，5 个循环；92℃ 3 min，92℃ 5 s，60℃ 30 s，40 个
循环，每个循环 60℃ 结束时收集荧光。
5.1.8.5.3 结果判定
本方法检验结果判定如下：
a） 阈值设定：阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪
器可根据仪器噪音情况进行调整；
b） 质控标准：阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。阳性对照的 Ct 值应≤ 30.0，并出现特定
的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。
c） 结果判定：无 Ct 值或 Ct 值＞ 40 并且无扩增曲线，表明样品中无 H3N8 亚型马流感病毒；
Ct 值≤ 35.0，且出现特定的扩增曲线，表明样本中存在 H3N8 亚型马流感病毒；35 ＜ Ct
值≤ 40，判定为可疑样品，对于可疑样品应重新提取核酸重新检测。
5.2 血清学检测方法
5.2.1 设备、材料和试剂
5.2.2.1 设备和材料
台式离心机、旋涡振荡器、冰箱（4℃ 和 -80℃）、水浴锅、高压锅、琼脂板、反应板微量可
调移液器（10 μL、200 μL、1 000 μL）。
5.2.2.2 试剂
盐水/HEPES、盐水/HEPES/BSA、三氯化铬母液、PBS（伦敦）/PBS“A”、PBS 琼脂糖，
配制见附录 D。
5.2.2 血凝抑制试验
马流感血凝抑制试验方法见标准 SN/T 1687。
5.2.3 单向辐射溶血试验（SRHT）
5.2.3.1 材料准备
5.2.3.1.1 病毒抗原：含有感染性病毒的尿囊液收获后要放在 -70℃ 保存。制备绵羊 RBC 时，用
短滴定曲线测定尿囊液最适用量。H7N7 流感病毒株总能产生清晰的溶血环，H3N8 株有时产生模
糊不清的环，此时需要超速离心浓缩病毒。
5.2.3.1.2 绵羊血：采血加到等体积阿氏液中，于 4℃ 保存。应试验几只绵羊的血，因各羊 RBC
特性不同，保存 2 d 后使用，如保持无菌状态，可使用 3 周。
5.2.3.1.3 补体：从体重 300 g~350 g 年轻的豚鼠收集血清，小体积分装，置于 -70℃ 保存。用
前用冷水融化，并置 4℃ 保存。
5.2.3.1.4 血清处理：血清不稀释，56℃ 灭活 30 min，避免反复冻融。
5.2.3.2 SRHT 试验程序
5.2.3.2.1 用盐水/HEPES 洗涤绵羊 RBC 至少三次。
5.2.3.2.2 用盐水/HEPES 制备适当体积的 8% 的 RBC（V/V 压积细胞），可根据要使用的平板数
计算，每板大致 10 mL，流出余额大约 1 mL~2。
5.2.3.2.3 加预定体积的病毒抗原到 8% RBC 溶液中，混合物在 4℃ 静止 10 min，此时可能会看
到凝集现象。
5.2.3.2.4 取病毒/RBC 液总体积 1/2 量的三氯化铬工作液（用 0.85% NaCl 将三氯化铬母液做
1: 400 稀释）缓慢地加入病毒/RBC 悬液中，在 22℃±2℃ 静置 5 min，偶尔摇动混合。
5.2.3.2.5 1 500 g 离心 5 min，沉积致敏的 RBC。
5.2.3.2.6 轻轻地再混悬于盐水/HEPES/BSA 中，1 500 g 离心 5 min。
......
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