路径: 主页 > SN/T > 第48页 > SN/T 5096-2019 | 标准编号 | SN/T 5096-2019 (SN/T5096-2019) | | 中文名称 | 国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法 | | 英文名称 | (Real-time fluorescent RT-PCR detection method for rumored lone star virus in border ports) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C62 | | 国际标准分类 | | | 字数估计 | 9,987 | | 发布日期 | 2019-09-03 | | 实施日期 | 2020-03-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2019年第142号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5096-2019
(Real-time fluorescent RT-PCR detection method for rumored lone star virus in border ports)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法
Real-time RT-PCR method for detecting Lone Star virus
in ticks at frontier ports
2019-09-03 发布
2020-03-01 实施
中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署 发 布
ICS 11.020
C 62
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前言
本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、中华人民共和国呼
和浩特海关。
本标准主要起草人：刘丽娟、曹晓梅、马爱敏、胡孔新、杨宇、徐宝梁、郭天宇、张胜、王静。
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国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法
1 范围
本标准规定了国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法的检测对象、生物安全和 PCR
防污染要求、仪器、试剂和检验程序。
本标准适用于对蜱传孤星病毒的检测。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
SN/T 1293 国境口岸蜱类监测规程
WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用
人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部 卫科教发〔2006〕15 号）
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
孤星病毒 Lone Star virus ；LSV
布尼亚病毒科白蛉病毒属成员，是单股负链节段性 RNA 病毒，有 S、M 和 L 片段。其中，L 片
段编码 RNA 依赖性 RNA 多聚酶，M 片段编码糖蛋白 Gn 和 Gc，S 片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白。
孤星病毒主要经蜱传播，经蜱叮咬后，人可能出现蜱传斑点热等症状。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp ：碱基对（base pair）
Ct 值：循环阈值（cycle threshold）
DEPC ：焦碳酸乙二酯（diethyl pyrocarbonate）
FAM ：6- 羧基 - 荧光素（6-carboxy-fluorescein）
RNA ：核糖核酸（ribonucleic acid）
ROX ：6- 羧基 -x- 罗丹明（6-carboxy-x-rhodamine）
RT-PCR ：逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reation）
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5 检测对象
5.1 国境口岸现场采集的蜱虫样本。
5.2 疑似被蜱虫叮咬且不能排除孤星病毒感染的人员。
6 生物安全和 PCR 防污染要求
6.1 生物安全要求
按照 GB 19489 和《人间感染的病原微生物名录》的要求，孤星病毒相关材料的生物安全要求如下：
--未经培养的孤星病毒感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行；
--孤星病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行；
--孤星病毒感染性材料运输和包装分为 B 类，UN 编号为 UN 3373。
6.2 PCR 防污染要求
PCR 防污染措施按 WS/T 230 的规定执行。
7 仪器
7.1 荧光定量 PCR 仪。
7.2 二级生物安全柜。
7.3 高压灭菌器。
7.4 -70℃超低温冰箱。
7.5 冷冻离心机。
7.6 旋涡振荡器。
8 试剂
8.1 DEPC 水
DEPC 处理过的不含 RNA 酶的水。
8.2 RNA 提取试剂盒
QIAamp Viral RNA kit，详见试剂盒说明书，内含 AVL、AW1、AW2 和 AVE 等 1）。a
8.3 一步法荧光 RT-PCR 试剂盒
Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit2）。b
1） 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，
则可使用这些等效产品。
2） 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，
则可使用这些等效产品。
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8.4 引物和探针
序列见表 1。
表 1 引物和探针序列
引物/探针名称 序列（5’-3’） 监测期
F CTTCCTTAACCCTCAGATA
扩增片段为 134 bpR CCTCTTTATGGTCCCTTA
注：探针的 5’端标记的是 FAM 荧光报告基团，3’端标记的是 BHQ1 荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和
淬灭基团或等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。
9 检验程序
9.1 样本采集
9.1.1 蜱虫样本的采集
按照 SN/T 1293 执行。
9.1.2 人血清样本的采集
无菌采集疑似病例发病 3 d 内静脉血 3 mL ~ 5 mL，室温静置 30 min 使其凝固，1 500 r/min~3 000 r/min
离心 10 min，收集血清于 2 mL 无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔登记编号，低温送到实验室
检测。如 24 h 内不能送到实验室，应将血清置于 -70 ℃冰箱保存。
9.2 实验室检验
9.2.1 样本处理
9.2.1.1 蜱虫样本
在无菌操作台上，将蜱取出放在无菌的平皿内，用 75% 酒精浸泡 20 min，用无菌滤纸吸干蜱
体表酒精，再用生理盐水漂洗 3 次，用无菌滤纸吸干蜱体表水分后，倒入研磨器中，加入 1 mL PBS
或生理盐水吹洗，弃去液体后加入 1 mL PBS 或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将
研磨液吸入 1.5 mL 离心管，预冷 4 ℃的离心机 20 000 r/min 离心 10 min，取上清液即可进行病
毒核酸提取。
9.2.1.2 血清样本
血清样本直接进行分子生物学核酸的提取，如 24 h 不能及时检测应存放在 -70℃冰箱。
9.2.2 病毒核酸提取
参照商品化试剂盒说明书进行，参见附录 A。
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9.2.3 实时荧光 RT-PCR 检测
9.2.3.1 引物和探针
引物和探针应用液浓度配制成 10 μmol/L，扩增片段大小 134 bp。探针的 5’ 端和 3’ 端分别用
FAM 和 BHQ1 标记。
9.2.3.2 阳性对照和空白对照设置
在检测过程中，分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为克隆孤星病毒的部分核苷酸序列（应包
含扩增区域）在体外转录合成的 cDNA ；空白对照用无菌双蒸水。
9.2.3.3 反应体系组成
见表 2。
表 2 孤星病毒实时荧光 RT-PCR 的反应体系
单位为微升（μL）
成 分 体 积
DEPC 水 4.5
2×RT-PCR 缓冲液 12.5
10 μmol/L 上游引物 1
10 μmol/L 下游引物 1
10 μmol/L 探针 0.5
酶混合物 0.5
模板 RNA/阴性对照/阳性对照 5
注：孤星病毒实时荧光 RT-PCR 的反应总体系为 25μL。
9.2.3.4 反应条件
一步法实时荧光 RT-PCR 检测扩增条件为：45 ℃ 10 min 1 次；95 ℃ 10 min 1 次；95 ℃ 15 s，
60 ℃ 45 s，共 40 个循环。每个循环结束时采集荧光信号。选择 FAM 通道于 60 ℃退火时收集荧光信号；
设置 ROX 通道为参比通道。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。
9.2.4 检验结果判断及报告
9.2.4.1 阈值确定
阈值确定的方法对所有的样本都是统一的，一般是以实时荧光 PCR 反应的前 3 ～ 15 个循环的荧
光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 10 倍作为荧光阈值，以样本扩增产生的荧光信号达
到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct 值）。
9.2.4.2 质量控制
反应结果应同时符合以下 2 个条件：
--阴性对照物未出现扩增曲线；
--阳性对照物 Ct 值≤ 35 并有明显扩增曲线。
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9.2.4.3 结果判断及报告
当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下：
--检测样本有明显的荧光扩增曲线，且 Ct 值≤ 35 时，判为阳性，报告“检出孤星病毒特异性
基因（实时荧光 RT-PCR 法）”。
--检测样本荧光扩增曲线的 Ct 值介于 35 和 40 之间时，建议重新进行实时荧光 RT-PCR 检测。
若重新检测的 Ct 值仍介于 35 和 40 之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告“检出孤星
病毒特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法）”，此类样本建议用其他方法进一步验证；否则判为阴性，
报告“未检出孤星病毒特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法）”。
--检测样本无荧光扩增现象，判为阴性，报告“未检出孤星病毒特异性基因（实时荧光
RT-PCR 法）”。
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附 录 A
（资料性附录）
RNA 病毒核酸提取
A.1 取蜱样本研磨液或细胞培养液上清 140 μL 加入 560 μL 裂解液（AVL），在旋涡混匀器上振
荡 15 s 混匀，室温静止 10 min。
A.2 加入 560 μL 无水乙醇终止反应，在旋涡混匀器上振荡 15 s 混匀......
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