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[PDF] SN/T 5119-2019 - 英文版

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SN/T 5119-2019	英文版	279	SN/T 5119-2019	[PDF]天数 >=3	进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱-质谱/质谱法	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5119-2019 (SN/T5119-2019)
中文名称	进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱-质谱/质谱法
英文名称	Determination of neomycin residues in edible animal for import and export - ELISA and LC-MS/MS
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	B40
国际标准分类
字数估计	13,155
发布日期	2019-09-03
实施日期	2020-03-01
标准依据	海关总署公告2019年第142号
发布机构	海关总署

SN/T 5119-2019: 进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱-质谱/质谱法 SN/T 5119-2019 英文名称: Determination of neomycin residues in edible animal for import and export - ELISA and LC-MS/MS 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱-质谱／质谱法中华人民共和国海关总署发布前言本标准按照GB/T １．１-２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国青岛海关。本标准主要起草人：孙明君、邱芳、张金玲、郑小龙、张晓文、梁成珠、孙涛、岳志芹、朱来华、王群。进出口食用动物中新霉素药物残留测定酶联免疫吸附法和液相色谱-质谱／质谱法１　范围本标准规定了进出口食用动物的血浆、尿液中新霉素残留的酶联免疫吸附测定方法和液相色谱质谱联用测定方法。本标准适用于进出口食用动物猪、牛、羊血液及尿液中新霉素残留量的快速检测。２　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T ６６８２-２００８　分析实验室用水规格和试验方法第一方法　酶联免疫吸附法３　原理基于竞争性酶联免疫反应，含有新霉素的抗原包被于微孔板上。药物分析时，样品同特异性一抗共同被添加到板孔中。如果样品中含有药物，会竞争一抗，抑制抗体与板上包被的药物抗原结合。加入酶标记二抗，形成包被抗原-抗体-酶标二抗复合物。加入底物后，产物的颜色强弱与样品中药物的浓度成反比。４　试剂与材料４．１　水：GB/T ６６８２-２００８中规定的二级水４．２　碳二亚胺：分析级４．３　卵清蛋白４．４　牛血清白蛋白４．５　透析袋４．６　包被缓冲液４．７　洗涤缓冲液４．８　封闭缓冲液４．９　稀释缓冲液４．１０　样品提取液４．１１　辣根过氧化物酶标记偶联物稀释液４．１２　底物液４．１３　显色剂液４．１４　终止液４．１５　抗体４．１６　ＨＲＰ偶联物４．１７　包被卵清蛋白偶联新霉素的聚苯乙烯微量９６孔反应板４．１８　标准品：硫酸新霉素，纯度９０％。４．１９　标准品贮备液：准确称取标准品，折合成目标化合物１０．０ｍｇ，用适量水溶解，并用水定容至１０ｍＬ，混匀。-１８℃以下避光保存，有效期为１２个月。４．２０　标准品中间液：用水稀释标准储备液至１０ｍｇ／Ｌ，４℃以下避光保存，有效期为６个月。４．２１　标准品工作液：用稀释缓冲液稀释标准中间液至工作浓度１．５μｇ／Ｌ、３μｇ／Ｌ、６μｇ／Ｌ、１２μｇ／Ｌ、３６μｇ／Ｌ，现用现配。注：４试剂与材料所涉及各种液体配制详见附录Ａ５　仪器和设备５．１　分析天平，感量０．０００１ｇ。５．２　酶标仪，带有４５０ｎｍ滤光片。５．３　离心机：转数≥８０００ｒ／ｍｉｎ。５．４　超声波发生器。５．５　微量移液器：单道２０μＬ、５０μＬ、１００μＬ和多道５０-３５０μＬ。５．６　酸度计：ｐＨ测量范围０-１４。５．７　涡旋式混合器。５．８　振荡器。６　测定步骤６．１　试样制备与保存６．１．１　试样制备分别采集动物血液１０ｍＬ于含有肝素钠的抗凝试管中、新鲜尿液５０ｍＬ装入洁净容器内，各分成两等份，作为试样密封并标明标记。在制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。６．１．２　试样保存试样置于４℃下可保存３-４天；若长期保存，需将试样置于-１８℃以下。６．２　提取取５０μＬ样品，加１．２ｍＬ样品提取液，混匀，４０００×ｇ离心５ｍｉｎ，上清液用于检测。６．３　酶联免疫测定６．３．１　根据待测样品数量和标准样品（每个样品２个平行），决定微孔的使用量。６．３．２　每孔加入１００μＬ含有卵清蛋白偶联新霉素抗原包被板４℃过夜。６．３．３　将微孔内液体垂直倒掉，加入２５０μＬ洗涤缓冲液，轻轻晃动后垂直倒掉，再重复洗涤微孔３次，在滤纸上用力垂直磕掉残留在壁上的液体。６．３．４　每孔加２５０μＬ２％牛血清白蛋白，３７℃封闭２小时。６．３．５　操作同６．３．３。６．３．６　每个微孔中加入５０μＬ标准溶液或待测样品溶液。６．３．７　在每个微孔中加入５０μＬ辣根酶标记物和５０μＬ抗体，混匀。６．３．８　室温（２０-２５）℃避光孵育３０ｍｉｎ。６．３．９　操作同６．３．３。６．３．１０　每个微孔加入５０μＬ底物液和５０μＬ显色剂液，充分混合并在室温（２０-２５）℃暗处孵育１５ｍｉｎ。６．３．１１　加入１００μＬ的终止液终止反应，充分混合后３０ｍｉｎ内于４５０ｎｍ处测量吸光度值。６．４　空白试验除不加试样外，均按６．３测定步骤进行。６．５　质控试验每次测定均应做一个用空白样品添加药物混合标样的质控样品，添加浓度应为相应产品的检测低限。７　结果计算７．１　标准曲线的绘制将６个浓度的标准溶液（０ｎｇ／ｍＬ、１．５ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、３６ｎｇ／ｍＬ）和待测溶液按限量法测定步骤测定得相应的吸光度值。以０浓度的吸光度Ａ０值为分母，其他标准浓度的吸光度Ａ值为分子的比值，再乘以１００，获得吸光度的百分比。以此吸光度百分比为纵坐标，对应的５个标准浓度为横坐标，在半对数坐标上绘制标准曲线。该定标模型在１．５ｎｇ／ｍＬ-３６ｎｇ／ｍＬ范围内是线性的。７．２　百分吸光度值的计算按式（１）计算百分吸光度值：百分吸光度值＝Ｂ样品Ｂ０ ×１００％（１）Ｂ样品---样品孔的平均吸光度值；Ｂ０ ---零标准的平均吸光度值。７．３　待测溶液中目标物含量的计算将样本的百分吸光度值代入标准曲线中，从标准曲线上得到相应的药物浓度ｃ（μｇ／Ｌ），按式（２）计算血浆和尿液中新霉素药物的残留量。８　方法性能指标８．１　灵敏度本方法在检测猪、牛、羊的血液和尿液样本中检测限为４０ｎｇ／ｍＬ。８．２　回收率本方法在１．５ｎｇ／ｍＬ-３６ｎｇ／ｍＬ添加浓度水平上的回收率为８０％-９５％。８．３　精密度对于定量分析，每个试样最少应取两份平行样进行分析。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的２０％。注：可使用经合格评定的等效的商品化ＥＬＩＳＡ试剂盒检测。第二方法　液相色谱串联质谱方法９　试剂材料９．１　水：GB/T ６６８２规定的一级水。９．２　甲醇：色谱级。９．３　乙腈：色谱级。９．４　磷酸：优级纯。９．５　甲酸：色谱级。９．６　甲酸铵：色谱级。９．７　庚烷磺酸钠：色谱纯。９．８　磷酸三钠：分析纯。９．９　提取液１：磷酸盐缓冲液（含５０ｍＭ庚烷磺酸钠、２５ｍＭ磷酸三钠），磷酸调ｐＨ＝２．０。９．１０　提取液２：磷酸盐缓冲液（含５０ｍＭ庚烷磺酸钠、２５ｍＭ磷酸三钠）。９．１１　ＳＰＥ柱：ＢＡＫＥＲＢＯＮＤｓｐｅＯｃｔａｅｃｙｌＣ１８。１０　仪器和设备１０．１　液相色谱-质谱串联仪：配有电喷雾离子源，ＡＢ公司。１０．２　均质器：Ｔ２５１８Ｇ，ＩＫＡ公司。１０．３　涡旋混匀器。１０．４　ｐＨ计：ＰＨＳ-３Ｃ，梅特勒。１０．５　高速冷冻离心机：ＨＩＴＡＣＨＩＣＲ２１ＧⅢ。１０．６　固相萃取仪：带正压空气泵，ＳＵＰＥＬＣＯ公司。１０．７　移液枪：２００μＬ、１０００μＬ、５０００μＬ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ。１１　测定步骤１１．１　提取按照６．１．１制备样品，从中取３ｇ至５０ｍＬ离心管中，加入１２ｍＬ提取液１（９．９），混匀震荡１５ｍｉｎ、１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，上清液至另一新的５０ｍＬ离心管中，加入１０ｍＬ正已烷，振荡混匀１０ｍｉｎ，８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃去上层液体，准确移取下层提取液１０ｍＬ至一新的５０ｍＬ离心管中，用提取液２（９．１０）调节ｐＨ＝４．０-４．５，待过柱净化。１１．２　净化ＳＰＥ柱净化，提前用５ｍＬ甲醇、５ｍＬ水预柱，调节好ｐＨ的提取液加贮液器中以小于等于３ｍＬ／ｍｉｎ的流速通过Ｃ１８柱，待液体完全流出后，用５ｍＬ水淋洗小柱，弃去所有流出液，正压吹干，最后用５ｍＬ甲醇洗脱，收集洗脱液至１５ｍＬ聚四氟乙烯圆底离心管，５０℃水浴氮气吹干，１．０ｍＬ流动相定溶过０．２２μｍ滤膜至进样小瓶，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。１１．３　测定１１．３．１　液相色谱条件１１．３．１．１　色谱柱：ＯｂｅｌｉＳＣＲ２．１×１５０ｍｍ，５μｍＬｏｔ：Ｓ０２-００２Ｃ。１１．３．１．２　流动相：Ａ有机相：乙腈；Ｂ水相：１％甲酸水溶液（含１０ｍＭ甲酸铵）梯度洗脱条件参见附录Ｂ。１１．３．１．３　流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ。１１．３．１．４　柱温：３０℃。１１．３．１．５　进样量：３０μＬ。１１．３．２　质谱条件１１．３．２．１　离子化模式：电喷雾电离正离子模式（ＥＳＩ＋）。１１．３．２．２　质谱扫描方式：多反应监测（ＭＲＭ）谱图参见附录Ｃ。１１．３．２．３　分辨率：单位分辨率。１１．３．２．４　其他质谱条件参参见附录Ｄ。１１．３．３　定性测定被测组分选择１个母离子，２个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与基标准溶液的保留时间偏差在±５......

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