路径: 主页 > SN/T > 第62页 > SN/T 5184-2020 | 标准编号 | SN/T 5184-2020 (SN/T5184-2020) | | 中文名称 | 禽副伤寒检疫技术规范 | | 英文名称 | (Technical specifications for avian paratyphoid quarantine) | | 行业 | 商检行业标准 (推荐) | | 中标分类 | B41 | | 国际标准分类 | 65.020.30 | | 字数估计 | 16,191 | | 发布日期 | 2020-12-30 | | 实施日期 | 2021-07-01 | | 标准依据 | 海关总署公告2020年第136号 | | 发布机构 | 海关总署 | SN/T 5184-2020: 禽副伤寒检疫技术规范
SN/T 5184-2020 英文名称: (Technical specifications for avian paratyphoid quarantine)
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
禽副伤寒检疫技术规范
中华人民共和国海关总署 发 布
前言
本文件按照 GB/T 1.1- 2 009 给出的规则编制。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本文件起草单位：中华人民共和国长春海关。
本文件主要起草人：孟日增、刘韬、孟庆峰、石建平、冯博、王宁、曲辉。
禽副伤寒检疫技术规范
1 范围
本文件规定了禽副伤寒的临床诊断、病理学诊断、病原分离与鉴定技术、玻片凝集试验和聚合
酶链式反应（PCR 法）。
本文件适用于进出境活鸡或散养鸡禽副伤寒现场诊断与实验室诊断。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文
件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适
用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
4 生物安全措施
样品采集、样品处理及检验过程所涉及的实验操作和防护要求应符合 GB 19489 的规定。
5 诊断技术
5.1 临床诊断
雏鸡副伤寒以急性败血型为主，往往孵出后不久很快死亡，看不到明显症状，10 d 左右的雏鸡
发病后，精神委顿，怕冷，头和翅膀下垂，羽毛松乱，喜欢拥挤在温暖的地方，食欲废绝，烦渴，
下痢，排出水样稀粪，肛门周围常被稀粪沾污。有的发生眼炎、失明，有的表现为呼吸困难。常在
1 d～2 d 内死亡，死亡率 10%～80%。
成年鸡感染后多不表现症状，成为慢性带菌者，肠道带菌的时间长达 9～16 个月。成年鸡感染后
厌食、下痢、脱水、全身衰弱、翅膀下垂和羽毛松乱，死亡率约 10%，大部分能在短期康复。
5.2 病理学诊断
剖检时， 最急性的往往病变不显著， 仅见肝脏淤血肿大，胆囊扩张， 充满胆汁。病程稍长的病鸡
死后显现消瘦、失水、卵黄凝固的症状。肝脏、脾脏发生淤血、有出血条纹或针尖大灰白色坏死点。
肾脏淤血。有心包炎，心包液增多， 含有纤维素性渗出物。小肠有出血性炎症， 尤以十二指肠最严重，
盲肠扩张，肠腔中有时有淡黄或白色干酪样物质堵塞。10 日龄以内幼雏常有肺炎病变。
5.3 病原分离与鉴定
5.3.1 试剂与材料
5.3.1.1 非选择性增菌液：缓冲蛋白胨水（BP），见 A.1。
5.3.1.2 选择性增菌液：亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、四硫磺酸钠煌绿增菌培养基（TTB）、RVS 大
豆蛋白胨增菌液（Rappaport-Vassiliadis soya peptone broth），见 A.2～A.4。
5.3.1.3 非选择性琼脂平板：血琼脂平板，营养琼脂平板，见 A.5～A.6。
5.3.1.4 选择性琼脂平板：亚硫酸铋琼脂（BS）、胆硫乳琼脂（DHL）、HE 琼脂（Hektoen Enteric
Agar）、木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂（XLD）、沙门氏菌显色培养基，见 A.7～A.11。
5.3.1.5 生化鉴定试剂：三糖铁琼脂、赖氨酸脱羧酶培养基、鸟氨酸脱羧酶培养基、尿素酶培养基、
半固体琼脂、糖发酵管、微量生化管、生化鉴定试剂盒或试剂条，见 A.12～A17。
5.3.1.6 诊断血清：A-F 多价 O 血清，O9 因子血清，O12 因子血清，H-a 因子血清，H-d 因子血清，
H-g.m 因子血清和 H-g.p 因子血清。
5.3.1.7 蒸馏水：用于配制培养基和试剂的蒸馏水需符合 GB/T 6682 二级水的要求。
5.3.2 设备与器材
5.3.2.1 生物安全柜。
5.3.2.2 全自动微生物鉴定系统。
5.3.2.3 恒温培养箱：25 ℃ ±1 ℃，30 ℃ ±1 ℃，35 ℃ ±1 ℃。
5.3.2.4 恒温水浴锅：46 ℃ ±1 ℃。
5.3.2.5 均质器或灭菌乳钵。
5.3.2.6 显微镜：10×～100×。
5.3.2.7 接种环、接种针。
5.3.2.8 锥形烧瓶。
5.3.2.9 灭菌试管：18 mm～180 mm。
5.3.2.10 灭菌吸管：10 mL（刻度精度 0.1 mL）和 1 mL（刻度精度 0.01 mL）。
5.3.2.11 灭菌量筒： 容量 100 mL 和 250 mL。
5.3.2.12 灭菌培养皿：直径 90 mm～100 mm。
5.3.2.13 可调微量移液器或移液管：10 μL～200 μL，50 μL～1 000 μL 及吸头。
5.3.3 病料采集与分离
5.3.3.1 泄殖腔和新鲜粪便拭子
将拭子直接划线接种于选择性培养基平板上后，将平板置于 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h，挑取可疑菌落
进行鉴定；同时将划线后的棉拭子置于选择性增菌液中，培养 24 h 和 48 h，转种于选择性琼脂平板
上。琼脂平板经 24 h 培养，直接挑取可疑菌落进行鉴定。
5.3.3.2 胆囊内容物
将胆囊内容物拭子划线于非选择性和选择性琼脂平板上。同时，将拭子分别置于非选择性和选择
性增菌液中，培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。
5.3.3.3 组织器官
将无菌采自个体的病变组织拭子或组织匀浆直接划线接种于非选择性和选择性琼脂平板上。之
后，将划过线的拭子或剩余组织匀浆分别置于非选择性和选择性增菌液中，36 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和
48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。
5.3.3.4 带菌鸡
对于带菌鸡的确诊需要大量的样品材料。分离鸡白痢沙门氏菌宜用卵和输卵管，分离鸡伤寒沙
门氏菌宜用肝脏和胆囊，也可用卵和输卵管。好的分离效果宜从各种组织包括脾脏中采取样品。用少
量肉汤将组织制成匀浆，直接划线于选择性和非选择性琼脂平板上，同时，各取 10 mL 分别接种到
90 mL 非选择性肉汤如缓冲蛋白胨水和 90 mL 选择性肉汤如 SC 中，于 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h，再划线
转种于选择性琼脂平板上。
5.3.3.5 消化道包括盲肠扁桃体和肠内容物
在 1 ：10 研磨或匀浆后，各取 10 mL 分别加入到 90 mLSC 和 90 mL TTB 选择性增菌肉汤中，分
别置 36 ℃ ±1 ℃和 42 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。
5.3.3.6 蛋壳
各取 10 g 碎蛋壳，分别加入到 90 mL SC 和 90 mL TTB 选择性增菌肉汤中，分别置于 36 ℃ ±1 ℃
和 41 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。
5.3.3.7 蛋内容物
无菌采取新鲜鸡蛋的内容物 25 g，加入 225 mL 缓冲蛋白胨水或营养肉汤搅拌匀浆，置 36 ℃ ±1 ℃
培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。孵过的蛋，不管是否受精或含有小胚胎，都可
作类似处理。
5.3.3.8 鸡胚
将鸡胚制成匀浆，直接划线接种于非选择性和选择性琼脂平板上。同时，分别取 1 g 组织匀浆接
种于 9 mL 非选择性增菌肉汤如缓冲蛋白胨水和选择性增菌肉汤如 SC 中，于 36 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和
48 h，再划线转种于非选择性和选择性琼脂平板上。
5.3.3.9 垫料等环境样品
包括粘附在孵化器的绒毛、蛋壳碎片或小鸡排泄物样品、出雏盒垫料、地板上粪便或垃圾样品
等。取 25 g 样品分别加入到 225 mL SC 和 225 mL TTB 中，混合均匀，分别置于 36 ℃ ±1 ℃和
42 ℃ ±1 ℃培养 24 h 和 48 h，再划线转种于选择性琼脂平板上。
5.3.4 病原生化鉴定
先用接种针在平板上挑取 5 个典型或可疑菌落分别接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再穿刺底
层；接种针无需灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶培养基或尿素酶培养基和营养琼脂平板。于 36 ℃ ±1 ℃
培养 24 h±2 h。必要时可延长至 48 h±3 h。沙门氏菌在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶培养基或尿素酶培
养基的反应分别见表 1 和表 2。
5.3.5 血清学鉴定
5.3.5.1 在洁净的玻片上划出 2 个 1 cm×2 cm 的区域，挑取一环待鉴定菌，各放 1/2 环于玻片上的
每一个区域上部，在其中一个区域下部加 1 滴沙门氏菌的 A-F 群“O”多价血清，在另一个区域下部
加 1 滴生理盐水作为对照。用无菌的接种环或针分别将两个区域的菌落研成乳状液。轻轻摇动玻片
1 min～2 min，在黑色背景下观察。如对照出现凝集，即判断菌株自凝，不能进行血清分型；如对照
不凝集，则试验区域的任何凝集现象均判为阳性反应。
5.3.5.2 如果培养物与 O1、O2、O4、O5、O6、O7、O12 因子血清呈阳性反应，与 H-a、H-b、H-c
因子血清呈阳性反应，则可判为禽副伤寒沙门氏菌。
5.4 玻片凝集试验
5.4.1 材料准备
5.4.1.1 禽副伤寒多价染色平板抗原、强阳性血清（500 IU/mL）、弱阳性血清（10 IU/mL）、阴性
血清。
5.4.1.2 玻璃板、吸管、金属丝环（内径 7.5 mm～8.0 mm）、反应盒、酒精灯、针头、消毒盘和酒精
棉等。
5.4.2 操作
在 20 ℃～25 ℃环境条件下，用定量滴管或吸管吸取抗原，垂直滴于玻璃板上 1 滴（相当于
0.05 mL），然后用针头刺破鸡的翅静脉或冠尖取血 0.05 mL（相当于内径 7.5 mm～8.0 mm 金属丝环
的两满环血液），与抗原充分混合均匀，并使其散开至直径为 2 cm，轻轻摇动玻璃板，计时判定结
果，同时设强阳性血清、弱阳性血清、阴性血清对照。
5.4.3 结果判定
5.4.3.1 凝集反应判定标准如下：
-- 100 % 凝集（#）：紫色凝集块大而明显，混合液稍浑浊；
-- 75 % 凝集（+ + +）：紫色凝集块较明显，但混合液有轻度浑浊；
-- 50 % 凝集 （+ +）： 出现明显的紫色凝集颗粒，但混合液较为浑浊；
-- 25% 凝集 （+）：仅出现少量的细小颗粒，而混合液浑浊；
--不凝集（-）：无凝集颗粒出现，混合液浑浊。
5.4.3.2 在 2 min 内，抗原与强阳性血清应呈 100% 凝集（#），弱阳性血清应呈 50% 凝集（+ +），阴
性血清不凝集（-），判试验有效。
5.4.3.3 在 2 min 内，被检全血与抗原出现 50%（+ +）以上凝集者为阳性，不发生凝集则为阴性，
介于两者之间为可疑反应，将可疑鸡隔离饲养 1 个月后，再作检疫，若仍为可疑反应，按阳性反应
判定。
5.5 聚合酶链式反应（PCR）
5.5.1 试剂和材料
5.5.1.1 对照品：副伤寒沙门氏菌标准菌株 DNA 提取物作为阳性对照，水作为阴性对照。
5.5.1.2 Pre-mix 2 倍预混液：包含 rTaq 酶、PCR 缓冲液、Mg2+、dCTP、dGTP、dATP、dTTP 等。
5.5.1.3 PCR 引物：上游引物 P1 为 5’-TAA CCG CAG CAA TTG ACG TTA CC-3’，下游引物 P2 为
5’-TCT CTA CGC ATT TCA CCG CTA CA -3’。
5.5.1.4 器材和设备： PCR 扩增仪、离心机、电泳仪、凝胶成像分析仪、微量移液器用吸头、普通冰
箱、低温冰箱、组织匀浆器或研磨器、灭菌离心管、吸头等。
5.5.2 PCR 样品准备
5.5.2.1 组织病料
采集待检病死鸡的病料约 1 g，剪碎后加 5 mL 水匀浆成糊状，煮沸 10 min，10 000 r/min 高速离
心 5 min，取上清液-20 ℃保存备用。
5.5.2.2 培养物
分离纯化的菌株用接种环刮取 2 个菌落洗脱于含 100 μL 无菌水的离心管，煮沸 10 min，10 000 r/min
高速离心 5 min，取上清液-20 ℃保存备用。
5.5.3 DNA 模板的制备
采用商品化 DNA 提取试剂盒抽提 DNA 模板，操作按说明书进行。
5.5.4 PCR 反应体系
2×Pre-mix 预混液 12.5 μL，引物 P1（20 pmol/μL）1.0 μL，引物 P2（20 pmol/μL）1.0 μL，......
|