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[PDF] SN/T 5276-2020 - 英文版

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SN/T 5276-2020	英文版	339	SN/T 5276-2020	[PDF]天数 >=4	出口食品中多种过敏原的测定液相色谱—质谱/质谱法	有效

基本信息
标准编号	SN/T 5276-2020 (SN/T5276-2020)
中文名称	出口食品中多种过敏原的测定液相色谱—质谱/质谱法
英文名称	(Determination of multiple allergens in export foods Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry)
行业	商检行业标准 (推荐)
中标分类	C53
国际标准分类	67.050
字数估计	16,160
发布日期	2020-08-27
实施日期	2021-03-01
标准依据	海关总署公告2020年第98号
发布机构	海关总署

SN/T 5276-2020: 出口食品中多种过敏原的测定液相色谱-质谱/质谱法 SN/T 5276-2020 英文名称: (Determination of multiple allergens in export foods Liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry) 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准出口食品中多种过敏原的测定液相色谱-质谱/质谱法中华人民共和国海关总署发布前言本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海海关、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：古淑青、邓晓军、陈颖、张九凯、赵超敏、时逸吟、陈念念、曲栗、韩丽。出口食品中多种过敏原的测定液相色谱-质谱/质谱法 1 范围本标准规定了加工食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生和坚果过敏原蛋白的液相色谱-质谱/质谱检测方法。本标准适用于饼干、面包、饮料、早餐谷物等食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和核桃过敏原蛋白的液相色谱-质谱/质谱测定和确证。 2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理试样中过敏原蛋白质经提取和纯化，二硫苏糖醇（DDT）还原, 碘代乙酰胺（IAA）烷基化，碱性胰蛋白酶酶解，液相色谱-质谱/质谱检测。建立特征肽段的响应强度与过敏原含量的线性关系，外标法定量。 4 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 4.1 试剂 4.1.1 碳酸氢铵（NH4HCO3）。 4.1.2 二硫苏糖醇（C4H10O2S2，DTT）。 4.1.3 碘代乙酰胺（ICH2CONH2，IAA）。 4.1.4 氯化钙（CaCl2）。 4.1.5 乙酸（CH3COOH）：色谱纯。 4.1.6 甲酸（HCOOH）：色谱纯。 4.1.7 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 4.1.8 碱性胰蛋白酶：活力大于 10 000 BAEE 每毫克蛋白质。 4.1.9 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）。 4.1.10 盐酸（HCl）。 4.1.11 正己烷（C6H14）：色谱纯。 4.2 试剂配制 4.2.1 碳酸氢铵溶液（500 mmol/L）：称取 3.95 g 碳酸氢铵（4.1.1），用水溶解后定容至 100 mL。 4.2.2 二硫苏糖醇溶液（500 mmol/L）：称取 0.771 g 二硫苏糖醇（4.1.2），用碳酸氢铵溶液（4.2.1）溶解后定容至 10 mL。4 ℃冷藏可保存一个月。 4.2.3 碘代乙酰胺溶液（500 mmol/L）：称取 0.925 g 碘代乙酰胺（4.1.3），用碳酸氢铵溶液（4.2.1）溶解后定容至 10 mL。4 ℃避光冷藏保存一个月。 4.2.4 氯化钙溶液（100 mmol/L）：称取 0.111 g 氯化钙（4.1.4），用水溶解后定容至 10 mL。 4.2.5 乙酸溶液（1%，体积比）：移取 0.1 mL 乙酸（4.1.5），用水稀释并定容至 10 mL。 4.2.6 牛胰蛋白酶溶液（500 μg/mL）：称取 5 mg 碱性牛胰蛋白酶（4.1.8），用乙酸溶液（4.2.5）溶解后定容至 10 mL。溶液于-20 ℃可保存 6个月。 4.2.7 甲酸的水溶液（0.1%，体积比）：准确移取 1.0 mL 甲酸（4.1.6），用水定容至 1 000 mL。 4.2.8 甲酸的乙腈溶液（0.1%，体积比）：准确移取 1.0 mL 甲酸（4.1.6），用乙腈（4.1.7）定容至 1 000 mL。 4.2.9 Tris-HCl 溶液（40 mmol/L）：称取 2.42 g Tris （三羟甲基氨基甲烷），溶解于 800 mL 水中，用 10%盐酸调节 pH至 8.0±0.10，用水定容至 1 000 mL。 4.3 标准品 4.3.1 NIST SRM 8445 ：用于过敏原检测的喷雾干燥的全蛋粉（spray-dried whole egg for allergen detection）。 4.3.2 NIST SRM 2387 ：花生酱（peanut butter）。 4.3.3 NIST SRM 1549a ：全脂奶粉（whole milk powder）。 4.3.4 NIST SRM 3234 ：大豆粉（soy flour）。（或其他来源的标准参考物质也可以。） 4.4 标准溶液配制 4.4.1 NIST SRM 8445、SRM 2387、SRM 1549a、SRM 3234 蛋白提取液标准储备液：分别准确称取 1 g NIST SRM 8445、SRM 2387、SRM 1549a、SRM 3234，加入 Tris-HCl（4.2.9）溶液，定容至 20 mL。振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅 60 ℃加热振荡提取 3 h。提取液以 10 000 r/min 高速离心 5 min，上清液过低蛋白质吸附的 0.45 μm 醋酸纤维滤膜后，用 Bradford 方法测定提取液中总蛋白的浓度，提取液置于-20 ℃冰箱内保存。 4.4.2 因难以购买到标准物质，实验中分别准确称取 1 g 烘焙后的榛子、核桃、杏仁，加入 Tris-HCl （4.2.9）溶液，定容至 20 mL。振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅 60 ℃加热振荡提取 3 h。提取液以 10 000 r/min 高速离心 5 min，上清液过低蛋白质吸附的 0.45 μm 醋酸纤维滤膜后，用 Bradford 方法测定提取液中总蛋白的浓度，提取液置于-20 ℃冰箱内保存。 4.4.3 系列标准工作溶液：准确移取适量的标准蛋白提取储备液，用空白基质溶液配制成最终浓度为含全脂奶粉、鸡蛋：5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、100 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L，花生、大豆、榛子、杏仁、核桃：10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、200 mg/L、800 mg/L、1 600 mg/L 的基质匹配标准工作溶液。 5 仪器和设备 5.1 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子（ESI）源。 5.2 分析天平：感量为 0.01 mg、0.001 g、0.1 g。 5.3 恒温水浴锅。 5.4 离心机：转速不低于 4 000 r/min。 5.5 离心管：50 mL 具塞塑料离心管，超滤离心管（10 kDa 截止膜），1.5 mL 低蛋白吸附离心管。 5.6 微孔滤膜：水相，0.22 μm。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 6.1.1 饼干、面制品、饮料、麦片取有代表性样品 500 g（精确至 0.1 g），采用粉碎机粉碎后，再将其研磨成细粉状，装入洁净的盛样容器内，密封并标明标记。 6.1.2 婴幼儿配方食品（不包括配方乳粉）取有代表性样品 500 g（精确至 0.1 g），装入洁净的盛样容器内，密封并标明标记。 6.2 试样保存在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 7 分析步骤 7.1 试样前处理称取混合均匀的固体试样约 2.0 g 或液体试样约 10 g（精确至 0.001g），于 50 mL 具塞塑料离心管中。对于脂肪含量高的样品，加入 10 mL 正己烷（4.1.11），涡旋 3 min 后，4 500 r/min 离心 5 min，除去上层溶液。重复两次后，氮气吹干。加入 20 mL Tris-HCl 溶液（4.2.9），振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅 60 ℃加热振荡提取 3 h。提取液以 10 000 r/min 高速离心 5 min，取上清液过低蛋白质吸附的 0.22 μm醋酸纤维滤膜。取上述蛋白粗提液 2 mL 加入带有分子量 10 kDa 截止膜的超滤离心管（5.5）中，以 10 000 r/min 高速离心 15 min，超滤去除小分子杂质；再向超滤离心管中加入 500 μL Tris-HCl 溶液（4.2.9），润洗超滤膜，以10 000 r/min高速离心至膜上剩余液体约200 μL，剩余体积可以从超滤管侧壁的刻度读取，将膜上液体收集至 1.5 mL 的低蛋白吸附离心管中（5.5）。 7.2 烷基化与酶解向上述离心管中，加入 150 μL 碳酸氢铵溶液（4.2.1）、10 μL 二硫苏糖醇溶液（4.2.2），混匀后置 75 ℃下恒温水浴 30 min ；冷却至室温，加入 30 μL 碘代乙酰胺溶液（4.2.3），暗处静置 30 min ；再加入 10 μL 氯化钙溶液（4.2.4）、50 μL 牛胰蛋白酶溶液（4.2.6），充分混匀后置于 37 ℃恒温水浴中酶解 5h（5.6）。用 10 μL 甲酸（4.1.6）混匀，室温下静置 15 min，加水定容至 1 mL，涡旋混匀，用 0.22 μm 滤膜过滤，供液相色谱串联质谱仪检测。 7.3 仪器参考条件 7.3.1 液相色谱条件液相色谱条件如下： a）色谱柱：C18 柱，100 mm×2.1 mm（内径），填料粒径 1.7 μm，孔径 30 nm（300 Å）或性能相当者； b）柱温：40 ℃； c）流动相：A，0.1% 的甲酸-水溶液（体积比），B：0.1% 的甲酸-乙腈溶液（体积比）。梯度洗脱程序见表 1； d）流速：0.4 mL/min ； e）进样量：10 μL。 7.4 测定 7.4.1 定性测定试样中目标物色谱峰的保留时间与相应基质匹配标准溶液色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5% 以内。样品中待测物的质谱定性离子与定量离子的比例应当与浓度相当标准工作溶液的相对离子比例 ......

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