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| 标准编号 | YY/T 1465.5-2016 (YY/T1465.5-2016) | | 中文名称 | 医疗器械免疫原性评价方法 第5部分:用M86抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率 | | 英文名称 | Immunogenic evaluation method of medical devices -- Part 5: Determination of α-Gal antigen clearance in medical devices utilizing animal tissues and their derivatives with M86 antibody | | 行业 | 医药行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C30 | | 字数估计 | 12,172 | | 发布日期 | 2016-07-29 | | 实施日期 | 2017-06-01 | | 起草单位 | 山东省医疗器械产品质量检验中心、四川医疗器械生物材料和制品检验中心、军事医学科学院野战输血研究所、烟台正海生物技术有限公司 | | 归口单位 | 全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC/TC 248) | | 标准依据 | State Food and Drug Administration Notice 2016 (No.129) | | 提出机构 | 国家食品药品监督管理总局 | | 发布机构 | 国家食品药品监督管理总局 | YY/T 1465.5-2016
Immunogenic evaluation method of medical devices--Part 5: Determination of α-Gal antigen clearance in medical devices utilizing animal tissues and their derivatives with M86 antibody
ICS 11.120.20
C30
中华人民共和国医药行业标准
医疗器械免疫原性评价方法
第5部分:用 M86抗体测定动物源性
医疗器械中α-Gal抗原清除率
2016-07-29发布
2017-06-01实施
国家食品药品监督管理总局 发 布
前言
YY/T 1465《医疗器械免疫原性评价方法》,分为以下部分:
---第1部分:体外T淋巴细胞转化试验;
---第2部分:血清免疫球蛋白和补体成分测定 ELISA法;
---第3部分:空斑形成细胞测定 琼脂固相法;
---第4部分:小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验 半体内法;
---第5部分:用 M86抗体测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率。
本部分为YY/T 1465的第5部分。
本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本部分由国家食品药品监督管理总局提出。
本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC/TC248)归口。
本部分起草单位:山东省医疗器械产品质量检验中心、四川医疗器械生物材料和制品检验中心、军
事医学科学院野战输血研究所、烟台正海生物技术有限公司。
本部分起草人:孙晓霞、刘成虎、袁暾、杨晓琴、高红伟、宫锋、陆美娇、张东刚。
引 言
α-Gal抗原是存在于哺乳动物(人类、猿类、简鼻猴除外)细胞膜上的糖蛋白和糖脂抗原。当人体接
受含有一定量α-Gal抗原的动物源性医疗器械/材料时可能发生超急性免疫排斥反应及慢性免疫毒性
反应。M86抗体是可以与天然或合成的糖蛋白和糖脂中α-Gal抗原结合的特异性单克隆抗体。基于
M86抗体的特异性,可以对动物源性医疗器械/材料中α-Gal抗原进行评价。
本部分使用 M86抗体,通过比较处理前后待测样品中α-Gal抗原含量,计算α-Gal抗原的清除率,
为动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除过程的有效性提供评价方法。本标准中的方法受试验样品处理
过程中α-Gal抗原活性、M86抗体效价稳定性等因素影响。试验者宜根据试验样品的特性对方法的适
用性进行确认。
医疗器械免疫原性评价方法
第5部分:用 M86抗体测定动物源性
医疗器械中α-Gal抗原清除率
1 范围
YY/T 1465的本部分给出了测定动物源性医疗器械中α-Gal抗原清除率的方法,适用于α-Gal抗
原清除过程有效性的评价。
本部分的方法适用于能通过研磨充分暴露α-Gal抗原的材料,如不能通过研磨充分暴露α-Gal抗
原,可考虑采用其他经确认的适宜方法。
注:附录A给出了免疫组织化学法评价方法的示例。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 16886.2 医疗器械生物学评价 第2部分:动物福利要求(GB/T 16886.2-2011,
ISO 10993-2:2006,IDT)
GB/T 16886.20 医疗器械生物学评价 第20部分:医疗器械免疫毒理学试验原则与方法
(GB/T 16886.20-2015,ISO/T S10993-20:2006,IDT)
YY/T 0771.1 动物源医疗器械 第1部分:风险管理应用(YY/T 0771.1-2009,ISO 22442-1:
2007,IDT)
中国药典 2010版
3 术语和定义
GB/T 16886.20和YY/T 0771.1界定的术语和定义适用于本文件。
4 试验原理
将试验样品和过量特异性 M86抗体共同孵育。分离剩余的 M86抗体并将其与预先包被在固相载
体上的过量α-Gal抗原结合,加底物显色。将最终显色结果与未经去α-Gal抗原处理的样品测定结果相
比,即可得到试验样品中α-Gal抗原的清除率。
5 试剂和仪器
5.1 试剂
5.1.1 磷酸盐缓冲液(PBS),pH7.2~7.4。
5.1.2 1%牛血清白蛋白(BSA)溶液:0.1gBSA溶于10mLPBS溶液中。
5.1.3 包被液(碳酸盐缓冲液,pH9.6)。
5.1.4 市售小鼠 M86抗体。
5.1.5 抗小鼠标记二抗。
5.1.6 市售α-Gal-BSA。
5.2 仪器和设备
5.2.1 酶标仪。
5.2.2 低温离心机。
5.2.3 震荡器。
5.2.4 高精度天平(0.0001g)。
6 试验步骤
6.1 试验样品处理
样品处理方法宜确保α-Gal抗原充分暴露,同时避免其被过度破坏。推荐经处理后的样品粒径分
布范围为(0μm~90μm)。附录B中给出了不同类型样品处理的实例。
注1:动物源性生物材料以胶原纤维等结构蛋白为主要组成成分,试验者宜采用适宜的样品制备方法以确保试验
样品中的α-Gal抗原充分暴露。
注2:每份样品设平行样3份,最终测定结果取其平均值。
注3:可以根据委托方的要求,取不同批号或同一批号的样品3份,用以评价不同批次或同一批次内的工艺稳
定性。
6.2 试验系统对照品制备
6.2.1 总则
考虑到本标准中的方法受多种因素的影响,试验前宜采用适当的对照品对试验体系的合理性进行
验证,推荐使用小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞或兔红细胞(RRBC)。如选用其他对照品,宜对其有效性进行
确认。
6.2.2 SP2/0细胞
SP2/0(ATCCCRL-1581TM)是由绵羊红细胞免疫的BALB/c小鼠的脾脏B细胞和小鼠骨髓瘤
细胞融合得到,不分泌免疫球蛋白。用RPMI1640完全培养基培养至生长状态良好,调整细胞浓度至
1×107 个/mL备用。
6.2.3 RRBC
6.2.3.1 推荐使用未进行过试验的健康新西兰家兔,SPF级。如选用其他品系家兔,宜对其适宜性进行
说明。取血前应将动物至少饲养5d以适应实验室环境。所有的动物试验应在经国家认可机构批准并
符合实验室动物福利全部适用法规的实验室内进行,并且还应符合GB/T 16886.2的要求。
6.2.3.2 取新鲜家兔全血20mL,加入含玻璃珠的锥形瓶中振摇10min,除去纤维蛋白。加入0.9%氯
化钠溶液约10倍量,摇匀,2000r/min离心5min,除去上清液,沉淀的红细胞再用0.9%氯化钠溶液按
上述方法洗涤3次,至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成1×107 个/mL,
4℃ 保存备用。
6.2.4 制备步骤
用40μL1%BSA重悬1×106 个SP2/0细胞或RRBC,混匀后取20μL细胞倍比稀释,共4个浓度
梯度(包括不含细胞的空白组)。分别向细胞原液及稀释液中加入1%BSA溶液,80μL/管,则最高浓
度组含细胞原液的体积比为20%,随着倍比稀释其余各组体积比呈梯度降低。每个浓度梯度3复孔
备用。
6.3 试验分组
试验分组包括:
a) 未经α-Gal抗原去除过程的材料组;
b) 经α-Gal抗原去除过程的材料组;
c) 阴性对照组,不含α-Gal抗原的材料;
d) 试验溶剂对照组。
6.4 最佳 M86抗体稀释度的测定
6.4.1 总则
不同批次 M86抗体的效价可能有一定的差异,宜确定每批次 M86抗体的最佳稀释度。将购买的
市售 M86等分成适宜体积,贮存备用。
6.4.2 α-Gal抗原标准品制备
取α-Gal-BSA溶于pH9.6的包被液,加入微孔板中,100μL/孔,推荐的终浓度为1μg/mL~
10μg/mL,4℃条件下包被过夜,用1%BSA封闭后备用。
6.4.3 M86抗体最佳稀释度
在每个微孔板中分别加入100μL倍比稀释的 M86抗体溶液,共8个稀释度,推荐初始稀释度为
1∶25,稀释度在1∶25与1∶3200之间。混匀,室温振荡孵育1.5h,用洗液洗板3次。加入 HRP标
记的抗小鼠二抗,37℃振荡孵育1h后,用洗液洗板3次。显色后,用酶标仪读取吸光度值,绘制吸光度
值与对应 M86稀释度的反应曲线。取反应曲线刚进入平台区稀释度的两倍浓度值作为最佳稀释度。
每次使用前将贮存的 M86抗体重新稀释。
6.5 M86抗体共孵育
在每个对照品和按6.3分组初始浓度相同的各试验管中分别加入160μL6.4确定的稀释比例的
M86抗体溶液,即每个反应管的总体积为200μL。混匀,4℃震荡孵育过夜,离心管在10000g 离心
5min后取上清液备用。
6.6 间接抑制ELISA法检测上清溶液中剩余 M86抗体
在96孔板的相应孔中加入过量的α-Gal抗原溶液,100μL/孔,4℃孵育过夜,用洗液洗板3次。分
别取按6.5制备的100μL上清液加入相应抗原包被的96孔板中,37℃振荡孵育2h后,用洗液洗板
3次。加入HRP标记的抗小鼠二抗,37℃振荡孵育1h后,用洗液洗板3次。显色后,用酶标仪读取吸
光度值。
7 数据分析
7.1 首先对试验体系对照品和试验样品进行3次重复测定,取3次测定的平均吸光度值,按式(1)计算
M86结合抑制率(剩余 M86结合率)。
I=
b ×100%
(1)
式中:
I---M86结合抑制率;
a---经α-Gal抗原去除过程的材料组、未经α-Gal抗原去除过程的材料组、阴性对照或试验体系
对照品的OD值;
b---溶剂对照的OD值。
7.2 用试验体系对照品 M86结合抑制率(3次重复测定)和相应稀释度获得结合抑制率曲线方程,R2
宜不小于0.96。
7.3 利用 M86结合抑制率为纵坐标(y),组织匀浆浓度为横坐标(x)绘制曲线。根据曲线求出50%,
结合抑制率对应各组样品浓度。按式(2)计算去除过程中α-Gal抗原的清除率:
C= 1-
÷×100% (2)
式中:
C ---α-Gal抗原的清除率;
x ---经α-Gal抗原去除过程的材料组50%结合抑制率对应的浓度;
y ---未经α-Gal抗原去除过程的材料组50%结合抑制率对应的浓度。
8 试验报告
试验报告中应至少包含下列信息:
a) 试验样品名称、规格型号和批号;
b) 样品制备方法;
c) 试验体系对照品信息;
d) 试验条件和试验步骤;
e) 试验结果。
附 录 A
(资料性附录)
免疫组织化学法测定酶解猪皮产品中α-Gal抗原清除率示例
A.1 试验原理
将特异性 M86抗体与试验样品中α-Gal抗原结合并以免疫组织化学法进行染色,通过比较α-Gal
抗原去除过程前后的显色程度,计算α-Gal抗原的清除率。
A.2 试剂和仪器
A.2.1 试剂
A.2.1.1 中性福尔马林。
A.2.1.2 5%BSA。
A.2.1.3 二甲苯。
A.2.1.4 小鼠 M86抗体。
A.2.1.5 PBS。
A.2.1.6 组织修复液。
A.2.1.7 乙醇。
A.2.2 仪器
A.2.2.1 烘箱。
A.2.2.2 组织切片器具。
A.2.2.3 光学显微镜。
A.3 实验程序
A.3.1 样品制备
取福尔马林保存固定的待测样品,常规石蜡包埋,切片,置60℃烘箱中烘烤过夜备用。
A.3.2 试验分组
按下列分组进行试验(每组5个样品,每个样品平行制备3张切片):
a) 阴性对照组,推荐选用不含α-Gal抗原的组织,如人脱细胞真皮或GGTA1基因敲除猪皮。
b) 阳性对照组,未经α-Gal抗原去除过程的猪皮肤样品。
c) 试验样品组,酶解去除α-Gal抗原的猪皮样品。
A.3.3 试验步骤
A.3.3.1 切片常规二甲苯脱蜡。梯度乙醇处理。
A.3.3.2 蒸馏水冲洗,PBS浸泡,5min/次,共2次。
A.3.3.3 微波修复10min,先将修复液加热至95℃~100℃再放入切片。
A.3.3.4 用3%过氧化氢在室温下孵育10min,阻断内源性过氧化物酶的活性。
A.3.3.5 PBS冲洗,5min/次,共3次。
A.3.3.6 用5%BSA溶液封闭30min。
A.3.3.7 加入6.4确定的适宜稀释度的 M86抗体,4℃孵育过夜。
A.3.3.8 用PBS冲洗切片,5min/次,共3次。
A.3.3.9 按说明书操作要求加入二抗工作溶液,室温或37℃孵育15min~20min。用PBS冲洗切片,
5min/次,共3次。
A.3.3.10 DAB显色显3min~15min。自来水充分冲洗。
A.3.3.11 如需要可进行苏木精(0.5%~1%)复染细胞核,脱水,透明,封片。
A.3.4 试验结果
图像分析软件进行免疫组化定量分析,将三组切片按照同一采集参数拍摄,每张切片随机采集高倍
视野(400×)图像10张。根据显色结果选定参数进行分析计算,结果按表A.1记录。
表A.1 各组样品显色评分表
切片编号
试验样品组
(去除α-Gal抗原的
酶解猪皮)
阳性对照组
(未经α-Gal抗原
去除过程的猪皮)
阴性对照组
(人脱细胞真皮或
GGTA1基因敲除猪皮)
记分平均值
A.3.5 结果评价
按式(A.1)计算去除过程α-Gal抗原的清除率。
I= 1-
÷×100% (A.1)
式中:
I---α-Gal抗原的清除率;
A---试验样品组记分平均值减去阴性对照组记分平均值;
B---阳性对照组记分平均值减去阴性对照组记分平均值。
附 录 B
(资料性附录)
样品处理示例
B.1 总则
样品处理宜确保α-Gal抗原的充分暴露,同时宜避免其被过度破坏。推荐使用组织匀质仪1)进行样
品处理,其他等效的处理方法也可使用,但使用者宜对所选择的试验参数进行确认。
B.2 样品处理
B.2.1 骨质类样品
对于骨植入物类样品,取100mg样品于1.5mL研磨瓶中,加8粒3mm和1粒5mm陶瓷磁珠,
转速为6800r/min,30s/次,液氮冷却研磨2次或更多次(间隔时间30s),至样品全部粉碎(粒径小于
100μm),置于冰上备用。取适量试验样品,精确称重并记录,放入0.5mL离心管中,加入1%BSA溶
液0.1mL。取匀浆液进行倍比梯度稀释,至少4个梯度。分别取40μL放在0.5mL离心管中备用。
B.2.2 干燥型样品
取适量试验样品,精确称重并记录,用无菌眼科剪将样品剪裁成适当大小,放进1.5mL研磨瓶中,
加入1%BSA溶液......
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