| 标准编号 | YY/T 1651.1-2019 (YY/T1651.1-2019) | | 中文名称 | 医疗器械溶血试验 第1部分：材料介导的溶血试验 | | 英文名称 | Tests for hemolysis of medical devices - Part 1: Material induced hemolysis assay | | 行业 | 医药行业标准 (推荐) | | 中标分类 | C30 | | 国际标准分类 | 11.040.01 | | 字数估计 | 10,193 | | 发布日期 | 2019 | | 实施日期 | 2020-06-01 | | 发布机构 | 国家药品监督管理局 | | 范围 | 本标准规定了吸光度测定溶血法和血红蛋白浓度测定溶血法，本标准适用于医疗器械/材料介导的溶血作用的评价。 | YY/T 1651.1-2019
Tests for hemolysis of medical devices - Part 1: Material induced hemolysis assay
ICS 11.040.01
C30
中华人民共和国医药行业标准
医疗器械溶血试验 第1部分:材料介导
的溶血试验
2019-05-31发布
2020-06-01实施
国家药品监督管理局 发 布
前言
YY/T 1651《医疗器械溶血试验》,分为以下部分:
---第1部分:材料介导的溶血试验;
---第2部分:机械力介导的溶血试验。
本部分为YY/T 1651的第1部分。
本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本部分由国家药品监督管理局提出。
本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会(SAC/TC248)归口。
本部分起草单位:山东省医疗器械产品质量检验中心、深圳市医疗器械检测中心、中国医学科学院
输血研究所、上海松力生物技术有限公司。
本部分主要起草人:赵增琳、侯丽、曹苹、钟锐、李芳娜。
引 言
医疗器械/材料的溶血作用是指医疗器械/材料或其可溶出物导致的红细胞膜破坏,血浆中游离血
红蛋白增加,从而产生的毒性生物学作用。医疗器械/材料的溶血作用一般分为材料介导的溶血和机械
力介导的溶血两大类。其中,材料介导的溶血试验可分为直接接触法和间接接触法。直接接触法指的
是医疗器械/材料表面由于物理和化学因素与红细胞直接接触而导致的溶血,间接接触法是指医疗器
械/材料中可溶出物与红细胞接触导致的溶血作用。机械力介导的溶血是指流体动力学因素诸如血液
流速、涡流,以及非生理性的剪切力导致的红细胞膜扭曲和破裂。
GB/T 16886.4中给出了医疗器械/材料血液相容性的试验原则以及试验的选择策略,但标准中未
给出具体的试验操作方法。本部分规定的吸光度测定溶血法和血红蛋白浓度测定溶血法。分别包含直
接接触溶血和间接接触溶血的测定,是对GB/T 16886.4的补充。使用者宜根据器械预期使用选择适
宜的溶血评价方法。
医疗器械溶血试验 第1部分:材料介导
的溶血试验
1 范围
YY/T 1651的本部分规定了吸光度测定溶血法和血红蛋白浓度测定溶血法。
本部分适用于医疗器械/材料介导的溶血作用的评价。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 16886.2 医疗器械生物学评价 第2部分:动物福利要求(GB/T 16886.2-2011,
ISO 10993-2:2006,IDT)
GB/T 16886.4 医疗器械生物学评价 第4部分:与血液相互作用试验选择(GB/T 16886.4-
2003,ISO 10993-4:2002,IDT)
GB/T 16886.12 医疗器械生物学评价 第12部分:样品制备与参照材料(GB/T 16886.12-
2017,ISO 10993-12:2012,IDT)
3 术语和定义
GB/T 16886.2、GB/T 16886.4、GB/T 16886.12界定的术语和定义适用于本文件。
4 血液制备
本实验选择动物为健康成年家兔,常用品系为新西兰白兔,雌雄不限。应符合GB/T 16886.2的要求。
分别从3只家兔中各抽取约5mL血液,收集在抗凝管中并混合在一起。使用前在(4±2)℃条件
下保存,推荐使用4h内新鲜采集的血液。宜在48h内用完。
注:根据实际需要可选择人血进行试验。人血要在符合有关健康、安全以及伦理相关强制性要求的前提下满足相应的合格准则。
5 吸光度测定溶血法
5.1 试验原理
将试验样品或其浸提液与新鲜抗凝血液接触后,若发生溶血反应,则红细胞中的血红蛋白释放入血
液中,离心后测定上清液的吸光度值,同时测定阴性和阳性对照吸光度值。通过将试验样品减去阴性对
照与阳性对照减去阴性对照的比值来计算试验样品的溶血率,用于评价试验样品的溶血作用。
5.2 试验仪器和试剂
5.2.1 试验仪器
分光光度计、恒温水浴锅、离心机等。
5.2.2 试剂及耗材
0.9%氯化钠注射液(SC)、蒸馏水、离心管、枸橼酸钠(0.109mol/L/3.2%)抗凝采血管,如选用其他
抗凝采血管,宜论证其适用性。
5.3 稀释血液制备
将8mL抗凝血加入到含10mLSC的容器中,轻轻摇晃混匀制备稀释血液。
5.4 样品制备
5.4.1 直接接触法
应根据GB/T 16886.12的原则制备试验样品,取适量的试验样品放入试管中,加入适量的SC完全
浸没试验样品。
注:可以使用其他比例,只要能模拟临床应用条件或测定潜在危害即可。
5.4.2 间接接触法
应根据GB/T 16886.12的原则,选择适宜的样品浸提比例和浸提条件制备浸提液。
注:如采用模拟临床使用的条件,则宜对潜在危害进行识别并论证其适宜性。
5.5 试验方法
5.5.1 直接接触法是将适量的试验样品分别加10mLSC备用。平行制备3管。
5.5.2 间接接触法是将浸提液充分混匀并转移10mL浸提液至对应新的试管中备用。平行制备3管。
注:若试验样品的本底颜色影响试验结果,则应同时设试验样品本底颜色对照组,试验样品组的实际吸光度值为吸
光度测得值减去本底吸光度值。
5.5.3 阴性对照组每管加入10mLSC;阳性对照组每管加入10mL蒸馏水。平行制备3管。同时制备
1管空白管,加入10mLSC。
5.5.4 将全部试管放入恒温水浴中(37±1)℃孵育30min后,按0.2mL稀释血液/10mLSC的比例,
在每个试管中(除空白管外)加入稀释血液,轻轻混匀。所有试验管置于(37±1)℃水浴中继续孵
育(60±5)min。
注:每30min轻轻上下颠倒试管2次,使血液与材料或浸提液完全接触。
5.5.5 孵育后轻轻混匀试管,将各管溶液转移至另一相应标记的离心管中,800g离心5min。吸取上
清液移入比色皿内,用空白管溶液调零,在分光光度计545nm波长处测定吸光度。
5.6 结果计算
试验组和对照组均取3支试管的吸光度平均值。按式(1)计算溶血率(HI)。
5.7 结果判定
阴性对照组的吸光度应不大于0.03,阳性对照组的吸光度应为0.9±0.2。否则应重新试验。溶血
率的测定结果大于5%表明试验样品具有溶血作用。
6 血红蛋白浓度测定溶血法
6.1 试验原理
当医疗器械/材料或其浸提液与血液接触后,医疗器械/材料本身或其可溶出物可能导致红细胞膜
破坏,血红蛋白释放,从而使游离血浆血红蛋白增加。通过测定游离血红蛋白含量与总血红蛋白含量来
计算溶血率,从而评价医疗器械/材料介导的溶血作用。
6.2 试验仪器和试剂
6.2.1 试验仪器
分光光度计、恒温水浴锅、离心机等。
6.2.2 试剂
不含钙镁离子的磷酸盐缓冲溶液(CMF-PBS)或0.9%氯化钠注射液(SC)、血红蛋白标准品1)、文齐
氏液2)、枸橼酸钠抗凝采血管(0.109mol/L),如选用其他抗凝采血管,宜论证其适用性。
6.3 试验对照材料
6.3.1 阴性对照材料
选取适宜的阴性对照材料(如聚乙烯)。阴性对照应不产生或产生较小的溶血作用。与空白对照相
比,阴性对照的溶血率应小于2%。
6.3.2 阳性对照材料
选取适宜的阳性对照材料(如丁腈手套)。阳性对照应能够产生稳定的溶血作用。与空白对照相
比,阳性对照的溶血率应大于5%。
6.4 试验前准备
6.4.1 血红蛋白(Hb)标准曲线的制作
将Hb标准品用文齐氏液在0.03mg/mL~0.70mg/mL范围内至少稀释成六个系列浓度(平行
3管),每次试验前新鲜配制标准品稀释液。用文齐氏液调零,540nm测定吸光度,以Hb标准品浓度为
Y 轴,540nm处吸光度(A540)为X 轴,绘制标准曲线。曲线的斜率记为校准系数(F),Y 轴截距应接近0点。
蛋白标准品。
2) 文齐氏液中的氰化钾为剧毒物质,实验室应具有相应的生物安全防护和处理措施。可选用都氏试剂代替文齐氏液,推荐的反应时间为15min。
6.4.2 血浆游离血红蛋白(PFH)测定
取3mL新鲜制备的抗凝兔血放置离心管中,700g~800g离心15min。取1mL血浆加入到含
有1mL文齐氏液的离心管中(稀释因子,DF=2),混匀,避光放置5min。用文齐氏液调零,在540nm
波长处测定吸光度(APFH)。计算血浆游离血红蛋白浓度(CPFH)。
注:若血浆游离血红蛋白浓度超过2mg/mL,则应重新采集血液进行试验。
6.4.3 全血血红蛋白(C)测定
取2支试管,分别加入20μL新鲜抗凝兔血,再加入5mL文齐氏液,室温避光放置5min,用文齐
氏液调零,在540nm波长处测定吸光度值Ac。计算全血血红蛋白浓度(C)。
6.4.4 稀释的全血血红蛋白浓度(T)和吸光度(AT)测定
用CMF-PBS或SC将C 调整为(10±1)mg/mL。取3支试管,将稀释的全血300μL加入4.5mL
文齐氏液中(DF=16),室温避光放置5min。用文齐氏液调零,在540nm波长处测定吸光度(AT)和稀
释的全血血红蛋白浓度(T)。
注:若3管全血血红蛋白平均浓度(Tavg)不在(10±1)mg/mL内,则宜通过稀释获得合适的浓度范围,重新进行上
述过程,使T 在(10±1)mg/mL内。
6.5 样品制备
6.5.1 直接接触法
应根据GB/T 16886.12的原则,取适量的试验样品放入试管中,加入适量的CMF-PBS或SC完全
浸没试验样品。对照材料组和空白对照组同法处理。每组平行制备3管。
注:可以使用其他比例,只要能模拟临床应用条件或测定潜在危害即可。
6.5.2 间接接触法
应根据GB/T 16886.12的原则,取适量的试验样品放入试管中,加入适量的CMF-PBS或SC完全
浸没试验样品,选择合适的温度和时间制备浸提液。对照材料组和空白对照组同法处理。每组平行制备3管。
注:可以使用其他比例,只要能模拟临床应用条件或测定潜在危害即可。
6.6 试验步骤
6.6.1 直接接触法
按照1mL稀释全血加入7mL液体的比例,每支试管中加入血红蛋白浓度为(10±1)mg/mL的稀
释兔血,于恒温水浴中(37±1)℃孵育3h,每隔30min上下颠倒混匀两次以确保血液与试验样品或材
料充分接触。倒出管内液体,700g~800g离心15min。记录上清液颜色并取1mL上清液加入1mL
文齐氏液,混匀,室温避光放置5min。用文齐氏液调零,用分光光度计在540nm波长处测定吸光度(AS)。
注:如果吸光度超过2,需要重新进行试验和确认。
6.6.2 间接接触法
浸提后分别转移7mL浸提液至另一相应标记的试管中。按照6.6.1步骤进行试验。
注:若上清液有背景颜色,需记录其吸光度,并用于校正......
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