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GB 15193.3-2014 相关标准英文版PDF, 自动发货

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基本信息
标准编号 GB 15193.3-2014 (GB15193.3-2014)
中文名称 食品安全国家标准 急性经口毒性试验
英文名称 National food safety standard - Acute toxicity test
行业 国家标准
中标分类 C53
国际标准分类 07.100
字数估计 23,276
发布日期 12/24/2014
实施日期 5/1/2015
旧标准 (被替代) GB 15193.3-2003
标准依据 卫计委公告2014年第21号
发布机构 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
范围 本标准规定了急性经口毒性试验的基本试验方法和技术要求。本标准适用于评价受试物的急性经口毒性作用。

GB 15193.3-2014 National Food Safety Standard.Acute toxicity test 中华人民共和国国家标准 食品安全国家标准 急性经口毒性试验 2014-12-24发布 2015-05-01实施 中 华 人 民 共 和 国 国家卫生和计划生育委员会 发 布 前言 本标准代替GB 15193.3-2003《急性毒性试验》。 本标准与GB 15193.3-2003相比,主要变化如下: ---标准名称修改为“食品安全国家标准 急性经口毒性试验”; ---修改了范围; ---增加了试验报告和试验的解释; ---修改了实验动物和试验方法; ---删除了最大耐受剂量法,增加了限量法和上-下法; ---修改了附录。 食品安全国家标准 急性经口毒性试验 1 范围 本标准规定了急性经口毒性试验的基本试验方法和技术要求。 本标准适用于评价受试物的急性经口毒性作用。 2 术语和定义 2.1 急性经口毒性 一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后,动物在短期内出现的毒性效应。 2.2 半数致死量(LD50) 经口一次或24h内多次给予受试物后,能够引起动物死亡率为50%的受试物剂量,该剂量为经过统 计得出的计算值。其单位是每千克体重所摄入受试物质的毫克数或克数,即mg/kg体重或g/kg体重。 3 试验目的和原理 急性经口毒性试验是检测和评价受试物毒性作用最基本的一项试验,即经口一次性或24h内多次 给予受试物后,在短期内观察动物所产生的毒性反应,包括中毒体征和死亡,通常用LD50来表示。 该试验可提供在短期内经口接触受试物所产生的健康危害信息;作为急性毒性分级的依据;为进一 步毒性试验提供剂量选择和观察指标的依据;初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机制。 4 试验方法 4.1 受试物 4.1.1 受试物的配制 应将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中,首选溶媒为水,不溶于水的受试物可使用植物油(如橄榄 油、玉米油等),不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或糊状物等。受试物 应新鲜配制,有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外。 4.1.2 受试物的给予 4.1.2.1 途径 经口灌胃。 4.1.2.2 试验前禁食 试验前动物需禁食,一般大鼠需整夜禁食(一般禁食16h左右),小鼠需禁食4h~6h,自由饮水。 给予受试物后大鼠需继续禁食3h~4h,小鼠需继续禁食1h~2h。若采用分批多次给予受试物,可根 据染毒间隔时间的长短给动物一定量的饲料。 4.1.2.3 灌胃体积 各受试物组的灌胃体积应相同,大鼠为10mL/kg体重,小鼠为20mL/kg体重。如果溶媒为水, 大鼠最大灌胃体积可达20mL/kg体重,小鼠可达40mL/kg体重。 4.1.2.4 方式 一般一次性给予受试物。也可一日内多次给予(每次间隔4h~6h,24h内不超过3次,尽可能达 到最大剂量,合并作为一次剂量计算)。 4.1.2.5 观察期限 一般观察14d,必要时延长到28d,特殊应急情况下至少观察7d。 4.2 实验动物 4.2.1 动物选择 实验动物的选择应符合国家标准和有关规定(GB 14923、GB 14922.1、GB 14922.2)。选择两种性别 的健康成年大鼠(180g~220g)和(或)小鼠(18g~22g),或选用其他实验动物。雌性动物应是未交配 过、未妊娠的。同性别实验动物个体间体重相差不超过平均体重的±20%。 4.2.2 动物准备 试验前实验动物在试验环境中至少应进行3d~5d环境适应和检疫观察。 4.2.3 动物饲养 实验动物饲养条件、饮用水、饲料应符合国家标准和有关规定(GB 14925、GB 5749、GB 14924.1、 GB 14924.2、GB 14924.3)。每个受试物组动物按性别分笼饲养。每笼动物数以不影响动物自由活动和 观察动物的体征为宜。对某些受试物常引起的特殊生物学特性及毒性反应(如易激动、互斗相残等)可 作单笼饲养。试验期间实验动物喂饲基础饲料,自由饮水。 4.3 几种常用的急性毒性试验设计方法 4.3.1 霍恩氏(Horn)法 4.3.1.1 预试验 根据受试物的性质和已知资料,选用下述方法:一般多采用100mg/kg体重,1000mg/kg体重和 10000mg/kg体重的剂量,各以2只~3只动物预试。根据24h内死亡情况,估计LD50的可能范围,确 定正式试验的剂量组。也可简单地直接采用一个剂量,如215mg/kg体重,用5只动物预试。观察2h 内动物的中毒表现。如中毒体征严重,估计多数动物可能死亡,即可采用低于215mg/kg体重的剂量 系列进入正式试验;反之中毒体征较轻,则可采用高于此剂量的剂量系列。如有相应的文献资料时可不 进行预试。 4.3.1.2 正式试验 4.3.1.2.1 动物数 一般每组10只动物,雌雄各半。 4.3.1.2.2 常用剂量系列 1.00 2.15 4.64 ïï ïï ×10t t=0,±1,±2,±3 1.00 3.16}×10t t=0,±1,±2,±3 因为剂量间距较1.00 3.16}×10t t=0,±1,±2,±3为小,所以结果较为精确。一般试验时,可根据上 述剂量系列设计5个组,即较原来的方法在最低剂量组以下或最高剂量组以上各增设一组,这样在查表 时容易得出结果。 4.3.1.2.3 观察 观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等,根据每组死亡动物数和所采用的剂量系列,查 表求得LD50(见附录A)。 4.3.2 限量法(limittest) 4.3.2.1 适用范围 该方法适用于有关资料显示毒性极小的或未显示毒性的受试物,给予动物一定剂量的受试物,仍不 出现死亡。 4.3.2.2 动物数 一般选20只动物,雌雄各半。 4.3.2.3 剂量 一般选用剂量至少应为10.0g/kg体重,如剂量达不到10.0g/kg体重,则给予动物最大剂量(最大 使用浓度和最大灌胃体积)。 4.3.2.4 观察 给予受试物后,观察期内无动物死亡,则认为受试物对某种动物的经口急性毒性耐受剂量大于某一 数值,其LD50大于该数值。如果动物出现死亡应选择其他方法。 4.3.3 上-下法(up-downprocedure,UDP) 4.3.3.1 适用范围 该方法主要适用于纯度较高、毒性较大、摄入量小且在给予受试物后动物1d~2d内死亡的受试 物,对预期给予受试物后动物在5d及以后死亡的受试物不适用。可按照试验者选择的剂量序列或在 专用软件包指导下进行试验,并对试验结果进行统计。 4.3.3.2 上-下法限量试验 以2000mg/kg体重剂量先给1只动物受试物,如果动物在48h内死亡,应进行正式试验。如果 动物在48h内存活,另取4只动物以相同的剂量给予受试物,如5只动物中有3只死亡,应进行正式试 验;如3只及以上的动物存活,结束试验,则该受试物LD50 >2000mg/kg体重。 如需要采用5000mg/kg体重剂量时,给1只动物受试物,如动物在48h内死亡,应进行正式试 验。如在48h内动物存活,另取2只动物,仍以相同剂量给予受试物,如在14d的观察期内动物全部存 活,结束试验,则该受试物LD50 >5000mg/kg体重;如果14d的观察期内后2只动物中有1只或2只 死亡,再追加2只动物,给予受试物后在14d观察期内5只动物中3只及以上动物存活,结束试验,该 受试物LD50 >5000mg/kg;如5只动物中3只及以上动物分别在14d观察期内死亡,应进行正式 试验。 4.3.3.3 正式试验 4.3.3.3.1 动物数 单一性别,实验动物数一般为6只~9只。 4.3.3.3.2 剂量 选择起始剂量和剂量梯度系数时,如果没有受试物 LD50的估计值资料,默认的起始剂量为 175mg/kg体重;如果没有受试物的剂量-反应曲线斜率的资料,默认的剂量梯度系数为3.2(是斜率为2时 的梯度系数),所设定的剂量系列为1.75mg/kg体重、5.5mg/kg体重、17.5mg/kg体重、55mg/kg体重、 175mg/kg体重、555mg/kg体重、2000mg/kg体重或1.75mg/kg体重、5.5mg/kg体重、17.5mg/kg体重、 55mg/kg体重、175mg/kg体重、555mg/kg体重、1750mg/kg体重、5000mg/kg体重。对于剂量- 反应曲线斜率比较平缓或较陡的受试物,剂量梯度系数可加大或缩小,起始剂量可作适当调整。附录B 列出了斜率为1~8的剂量梯度。 4.3.3.3.3 方法 试验开始时称量禁食后动物的体重,计算灌胃体积。经口灌胃,一次一只动物,每只动物的灌胃间 隔时间为48h。第二只动物的剂量取决于第一只动物的毒性结果,如动物呈濒死状态或死亡,剂量就 下调一级;如动物存活,剂量就上调一级。 4.3.3.3.4 终止试验的规定 是否继续给予受试物取决于固定的时间间隔期内所有动物的生存状态,首次达到以下任何一种情 况时,即可终止试验: a) 在较高剂量给予受试物中连续有3只动物存活; b) 连续6只动物给予受试物后出现5个相反结果; c) 在第一次出现相反结果后,继续给予受试物至少4只动物,并且从第一次出现相反结果后计算 每一个剂量的似然值,其给定的似然比超过临界值。 依照试验结束时的动物生存状态即可计算受试物的LD50。附录C描述了正式试验LD50估计值和 可信限的计算方法及特殊情况的处理方法。 如果给予受试物后动物在试验的后期才死亡,而较该剂量还高的动物仍处于存活状态,应当暂时停 止继续给予受试物,观察其他动物是否也出现延迟死亡。当所有已经给予受试物的动物其结局明确后 再继续染毒。如果后面的动物也出现延迟死亡,表示所有染毒的剂量水平都超过了LD50,应当选择更 适当的、低于已经死亡的最低剂量的两个剂量级重新开始试验,并要延长观察期限。统计时延迟死亡的 动物按死亡来计算。 4.3.4 寇氏(Korbor)法 4.3.4.1 预试验 除另有要求外,一般应在预试验中求得动物全死亡或90%以上死亡的剂量和动物不死亡或10%以 下死亡的剂量,分别作为正式试验的最高剂量与最低剂量。 4.3.4.2 动物数 除另有要求外,一般设5个~10个剂量组,每组每种性别以6只~10只动物为宜。 4.3.4.3 剂量 将由预试验得出的最高、最低剂量换算为常用对数,然后将最高、最低剂量的对数差,按所需要的组 数,分为几个对数等距(或不等距)的剂量组。 4.3.4.4 观察 给予受试物后,观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等。 4.3.4.5 试验结果的计算与统计 4.3.4.5.1 列出试验数据及其计算表 包括各组剂量(mg/kg体重,g/kg体重)、剂量对数(X)、动物数(n)、动物死亡数(r)、动物死亡百分 比(P,以小数表示),以及统计公式中要求的其他计算数据项目。 4.3.4.5.2 LD50的计算公式 根据试验条件及试验结果,可分别选用下列三个公式中的一个,求出lgLD50,再查其自然数,即为 LD50(mg/kg体重,g/kg体重)。 按本试验设计得出的任何结果,均可用式(1)计算: lgLD50=∑ (Xi+Xi+1)×(Pi+1-Pi) (1) 式中: Xi与Xi+1---相邻两组的剂量对数; Pi+1与Pi---相邻两组动物死亡百分比。 按本试验设计且各组间剂量对数等距时,可用式(2)计算: lgLD50=XK- (Pi+Pi+1) (2) 式中: XK---最高剂量对数; 其他同式(1)。 按本试验设计且各组间剂量对数等距且最高、最低剂量组动物死亡百分比分别为100(全死)和0 (全不死时),则可用便于计算的式(3)计算。 lgLD50=XK-d(∑P-0.5) (3) 式中: ∑P---各组动物死亡百分比之和; 其他同式(2)。 4.3.4.5.3 标准误与95%可信限 lgLD50的标准误(S)的计算见式(4): SlgLD50=d ∑Pi(1-Pi) (4) 95%可信限(X)的计算见式(5): X=lg-1(lgLD50±1.96·SlgLD50) (5) 注:此法易于了解,计算简便,可信限不大,结果可靠,特别是在试验前对受试物的急性毒性程度了解不多时,尤为 适用。 4.3.5 机率单位---对数图解法 4.3.5.1 预试验 以每组2只~3只动物找出全死和全不死的剂量。 4.3.5.2 动物数 一般每组每种性别不少于10只,各组动物数不一定要求相等。 4.3.5.3 剂量及分组 一般在预试验得到的两个剂量组之间拟出等比的六个剂量组或更多剂量组。此法不要求剂量组间 呈等比关系,但等比可使各点距离相等,有利于作图。 4.3.5.4 观察 给予受试物后,观察期内记录动物死亡数、死亡时间及中毒表现等。 4.3.5.5 作图计算 4.3.5.5.1 将各组按剂量及死亡百分率,在对数概率纸上作图。除死亡百分率为0%及100%外,也可 将剂量化成对数,并将百分率查概率单位表(见附录D)得其相应的概率单位作点于普通算术格纸上, 0%及100%死亡率在理论上不存在,为计算需要用式(6)和式(7)代替: 0%= 0.25×100 N % (6) 100%= (N-0.25) N ×100% (7) 式中: N---该组动物数,相当于0%及100%的作图用概率单位(见附录E)。 4.3.5.5.2 划出直线,以透明尺目测,并照顾概率。 4.3.5.6 计算标准误 标准误计算见式(8): SE= 2S 2N' (8) 式中: SE ---标准误; 2S ---LD84与LD16之差,即2S=LD84-LD16(或ED84-ED16); N'---概率单位3.5~6.5之间(反应百分率为6.7%~93.7%)各组动物数之和。 注:相当于LD84及LD16的剂量均可从所作直线上找到。也可用普通方格纸作图,查表将剂量换算成对数值,将死 亡率换算成概率单位,方格纸横坐标为剂量对数,纵坐标为概率单位,根据剂量对数及概率单位作点连成线,由 概率单位5处作一水平线与直线相交,由相交点向横坐标作一垂直线,在横坐标上的相交点即为剂量对数值, 求反对数LD50值。 4.3.6 急性联合毒性试验 4.3.6.1 原理 两种或两种以上的受试物同时存在时,可能发生拮抗、相加或协同三种不同的联合作用方式,可以 根据一定的公式计算和判定标准来确定这三种不同的作用。 4.3.6.2 步骤 4.3.6.2.1 分别测定单个受试物的LD50,方法同4.3.1、4.3.2、4.3.3、4.3.4、4.3.5。 4.3.6.2.2 按各受试物的LD50值的比例配制等毒性的混合受试物。 4.3.6.2.3 测定混合物的LD50,用其他LD50测定方法时,可以按各个受试物的LD50值的二分之一之和 作为中组,然后按等比级数向上、下推算几组,与单个受试物LD50测定的设计相同,如估计是相加作用, 可向上、下各推算两组;如可能为协同作用,则可向下多设几组;如可能为拮抗作用,则可向上多设几组。 4.3.6.3 计算 4.3.6.3.1 混合物中各个受试物是以等毒比例混合的,因此求出的LD50乘以各受试物的比例,即可求得 各受试物的剂量。 4.3.6.3.2 用式(9)计算混合物的预期LD50值的比值,按比值判定作用的方式。 混合物的预期LD50 值= 受试物A的LD50 值+ 受试物B的LD50 值+ 受试物N 的LD50 值 (9) 式中: a、bn---A、BN 各受试物在混合物中所占的质量比例,a+b++n=1。 4.3.6.3.3 判定受试物联合作用方式的比值采用Keplinger的规定,即小于0.57为拮抗作用,0.57~ 1.75为相加作用,大于1.75为协同作用。 4.4 观察指标 4.4.1 临床观察 观察包括皮肤、被毛、眼、黏膜以及呼吸系统、泌尿生殖系统、消化系统和神经系统等,特别要注意观 察有无震颤、惊厥、流涎、腹泻、呆滞、嗜睡和昏迷等(见附录F)。在试验开始和结束时称取并记录动物 体重,并且在观察期每周至少称取动物体重1次。全面观察并记录动物变化发生的时间、程度和持续时 间,评估可能的毒作用靶器官。如发现动物处于濒死或表现出严重的疼痛和持续的痛苦状态应处死动 物。死亡时间记录应当尽可能的精确。 4.4.2 病理学检查 所有的动物包括试验期间死亡、人道处死和试验结束处死的动物都要进行大体解剖检查,记录每只 动物大体病理学变化,出现大体解剖病理改变时应做病理组织学观察。 5 数据处理和结果评价 描述由中毒表现初步提示的毒作用特征,根据LD50值确定受试物的急性毒性分级(见附录G)。 6 报告 6.1 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号。 6.2 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期。 6.3 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期。 6.4 试验摘要。 6.5 受试物:名称、批号、剂型、状态(包括感官、性状、包装完整性、标识)、数量、前处理方法、溶媒。 6.6 实验动物:物种、品系、级别、数量、体重、性别、来源(供应商名称、实验动物生产许可证号)、动物检 疫、适应情况,饲养环境(温度、相对湿度、实验动物设施使用许可证号),饲料来源(供应商、实验动物饲 料生产许可证号)。 6.7 试验方法:试验分组、每组动物数、剂量选择依据、受试物给予途径及期限、观察指标、统计学方法。 6.8 试验结果:动物生长活动情况、体重、体重增长、每只动物的反应(包括动物的毒性体征、严重程度、 持续时间、是否可逆的、死亡率列表、每只动物大体解剖、病理组织学所见、LD50和95%可信限,给出结 果的统计处理方法。 6.9 试验结论:受试物经口急性毒性的特点、可逆性、可能的靶器官、LD50和95%可信限以及急性经口 毒性分级。 7 试验的解释 急性经口毒性试验可提供在短时间内经口接触受试物所产生的健康危害信息,为进一步毒性试验 的剂量选择提供依据,并初步估测毒作用的靶器官和可能的毒作用机制。但由于动物和人存在种属差 异,故试验结果外推到人存在一定的局限性。 附 录 A 霍恩氏(Horn)法LD50值计算(剂量递增法测定LD50计算用表) A.1 表A.1用于每组5只动物,其剂量递增公比为 10,意即10× 10=21.5,21.5× 10=46.4,余 此类推。此剂量系列排列如下: 1.00 2.15 4.64 ïï ïï ×10t t=0,±1,±2,±3 表A.1 霍恩氏(Horn)法LD50值计算(剂量递增公比为 10) 组1 组2 组3 组4 组1 组3 组2 组4 剂量1=0.464 剂量2=1.00 剂量3=2.15 剂量4=4.64 ×10t 剂量1=1.00 剂量2=2.15 剂量3=4.64 剂量4=10.0 ×10t 剂量1=2.15 剂量2=4.64 剂量3=10.0 剂量4=21.5 ×10t LD50 可信限 LD50 可信限 LD50 可信限 0 0 3 5 2.00 1.37~2.91 4.30 2.95~6.26 9.26 6.36~13.5 0 0 4 5 1.71 1.26~2.33 3.69 2.71~5.01 7.94 5.84~10.8 0 0 5 5 1.47 ~ 3.16 ~ 6.81 ~ 0 1 2 5 2.00 1.23~3.24 4.30 2.65~6.98 9.26 5.70~15.0 0 1 3 5 1.71 1.05~2.78 3.69 2.27~5.99 7.94 4.89~12.9 0 1 4 5 1.47 0.951~2.27 3.16 2.05~4.88 6.81 4.41~10.5 0 1 5 5 1.26 0.926~1.71 2.71 2.00~3.69 5.84 4.30~7.94 0 2 2 5 1.71 1.01~2.91 3.69 2.17~6.28 7.94 4.67~13.5 0 2 3 5 1.47 0.862~2.50 3.16 1.86~5.38 6.81 4.00~13.5 0 2 4 5 1.26 0.775~2.05 2.71 1.69~4.41 5.84 3.60~9.50 0 2 5 5 1.08 0.741~1.57 2.33 1.60~3.99 5.01 3.44~7.30 0 3 3 5 1.26 0.740~2.14 2.71 1.59~4.62 5.84 3.43~9.95 0 3 4 5 1.03 0.665~1.75 2.33 1.43~3.78 5.01 3.08~8.14 1 0 3 5 1.96 1.22~3.14 4.22 2.63~6.76 9.09 5.66~14.6 1 0 4 5 1.62 1.07~2.43 3.48 2.31~5.24 7.50 4.98~11.3 1 0 5 5 1.33 1.05~1.70 2.87 2.26~3.65 6.19 4.87~7.87 1 1 2 5 1.96 1.06~3.60 4.22 2.29~7.75 9.09 4.94~16.7 1 1 3 5 1.62 0.866~3.01 3.48 1.87~6.49 7.50 4.02~16.7 1 1 4 5 1.33 0.737~2.41 2.87 1.59~5.20 6.19 3.42~11.2 1 1 5 5 1.10 0.661~1.83 2.37 1.42~3.95 5.11 3.07~8.51 1 2 2 5 1.62 0.818~3.19 3.48 1.76~6.37 7.50 3.80~14.8 1 2 3 5 1.33 0.658~2.70 2.87 1.42~5.82 6.19 3.05~12.5 1 2 4 5 1.10 0.550~2.20 2.37 1.19~4.74 5.11 2.55~10.2 1 3 3 5 1.10 0.523~2.32 2.37 1.13~4.99 5.11 2.43~10.8 2 0 3 5 1.90 1.00~3.58 4.08 2.16~7.71 8.80 4.66~16.6 表A.1(续) 组1 组2 组3 组4 组1 组3 组2 组4 剂量1=0.464 剂量2=1.00 剂量3=2.15 剂量4=4.64 ×10t 剂量1=1.00 剂量2=2.15 剂量3=4.64 剂量4=10.0 ×10t 剂量1=2.15 剂量2=4.64 剂量3=10.0 剂量4=21.5 ×10t LD50 可信限 LD50 可信限 LD50 可信限 2 0 4 5 1.47 0.806~2.67 3.16 1.74~5.76 6.81 3.74~12.4 2 0 5 5 1.14 0.674~1.92 2.45 1.45~4.13 5.28 3.13~8.89 2 1 2 5 1.90 0.839~4.29 4.08 1.81~9.23 8.80 3.89~19.9 2 1 3 5 1.47 0.616~3.50 3.16 1.33~7.53 6.81 2.86~16.2 2 1 4 5 1.14 0.466~2.77 2.45 1.00~5.98 5.28 2.16~12.9 ......