| 标准编号 | GB/T 13091-2018 (GB/T13091-2018) | | 中文名称 | 饲料中沙门氏菌的测定 | | 英文名称 | Determination of Salmonella in feeds | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | B46 | | 国际标准分类 | 65.120 | | 字数估计 | 18,149 | | 发布日期 | 2018-09-17 | | 实施日期 | 2019-04-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 13091-2002 | | 标准依据 | 国家标准公告2018年第11号 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 13091-2018: 饲料中沙门氏菌的测定
GB/T 13091-2018 英文名称: Determination of Salmonella in feeds
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 13091-2002
饲料中沙门氏菌的测定
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
中国国家标准化管理委员会 发 布
前言
本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。
本标准代替GB/T 13091-2002《饲料中沙门氏菌的检测方法》。
本标准与GB/T 13091-2002相比,除编辑性修改外,主要变化如下:
---删除了术语和定义(见2002年版的第3章);
---删除了原理(见2002年版的第4章);
---增加了试验程序图(见附录A图A.1);
---修改了增菌器具,并增加了均质袋及均质器选项(见6.1,2002年版的9.1.2);
---将分离培养基由“酚红煌绿琼脂和DHL琼脂”改为“BS琼脂,DHL琼脂或沙门氏菌显色培养
基”(见6.3,2002年版的9.4);
---修改了鉴定流程和鉴定表(见6.4,2002年版的9.5);
---增加了“利用三糖铁试验和赖氨酸脱羧酶试验进行初步判断”步骤(见6.4.1);
---增加了“生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统”进行沙门氏菌鉴定选项(见6.4.3)。
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)提出并归口。
本标准起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心
(北京)]。
本标准主要起草人:饶正华、刘晓露、樊霞。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:
---GB/T 13091-1991、GB/T 13091-2002。
饲料中沙门氏菌的测定
1 范围
本标准规定了饲料中沙门氏菌的检验方法。
本标准适用于饲料和饲料添加剂中沙门氏菌的检验。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 培养基或材料
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂。
3.1 水:应符合 GB/T 6682中三级水的要求。
3.2 缓冲蛋白胨水(BPW):见附录B中B.1。
3.3 氯化镁孔雀绿(RV)增菌液:见附录B中B.2。
3.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见附录B中B.3。
3.5 亚硫酸铋(BS)琼脂:见附录B中B.4。
3.6 胆硫乳(DHL)琼脂:见附录B中B.5。
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 营养琼脂(NA):见附录B中B.6。
3.9 三糖铁琼脂(TSI):见附录B中B.7。
3.10 蛋白胨水、靛基质试剂:见附录B中B.8。
3.11 尿素琼脂(pH7.2):见附录B中B.9。
3.12 氰化钾(KCN)培养基:见附录B中B.10。
3.13 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见附录B中B.11。
3.14 糖发酵管:见附录B中B.12。
3.15 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见附录B中B.13。
3.16 半固体琼脂:见附录B中B.14。
3.17 丙二酸钠培养基:见附录B中B.15。
3.18 沙门氏菌因子O和H多价诊断血清,Vi因子诊断血清。
4 仪器设备
4.1 冰箱:2℃~5℃。
4.2 恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。
4.3 均质器。
4.4 振荡器。
4.5 电子天平:感量0.1g。
4.6 无菌锥形瓶:容量500mL、250mL,或无菌均质袋。
4.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
4.8 无菌培养皿:直径60mm,90mm。
4.9 无菌试管:3mm×50mm、10mm×75mm。
4.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
4.11 全自动微生物生化鉴定系统。
5 样品
5.1 采样原则
样品的采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程应遵循无菌操作程序,防止一切可能的外来
污染。
5.2 采样方法
5.2.1 应在同一批次产品中采集样品,每件样品的采样量应满足微生物指标检验的要求,一般不少于
500g(mL)。
5.2.2 独立包装不大于500g的固态产品或不大于500mL的液态产品,取完整包装。
5.2.3 独立包装大于500mL的液态产品,应在采样前摇动或用无菌棒搅拌液体,使其达到均匀后采集
适量样品,放入无菌采样容器内作为一件样品。
5.2.4 独立包装大于500g的固态产品,应用无菌采样器从同一包装的不同部位分别采取适量样品,放
入同一个无菌采样容器内作为一件样品。
5.3 采集样品的贮存和运输
5.3.1 应尽快将样品送往实验室检验。
5.3.2 应在运输过程中保持样品完整。
5.3.3 应在接近原有贮存温度条件下贮存样品,或采取必要措施防止样品中微生物数量的变化。
6 试验方法(试验程序图见附录A)
6.1 前增菌
无菌条件下称取25g(mL)样品,加入装有225mL灭菌BPW的500mL无菌锥形瓶内,置于振荡
器中,以8000r/min~10000r/min振荡2min~3min;若样品为液态,振荡混匀即可。36℃±1℃培
养18h±2h。
注:可用无菌均质袋代替锥形瓶,然后用均质器拍打2min~3min,但有坚硬或棱角的样品不能够使用均质袋,只
能使用锥形瓶,以防均质和增菌过程中均质袋破裂泄漏,造成污染。
6.2 选择性增菌
前增菌培养物摇匀后,取1mL接种于装有10mLRV的试管中,于42℃±1℃培养18h~24h。
另取前增菌培养物1mL,接种于装有10mLSC的试管中,36℃±1℃培养18h~24h。
6.3 分离培养
用接种环取1环选择性增菌液,划线接种于BS琼脂平板上,于36℃±1℃培养40h~48h。另取
1环选择性增菌液,划线接种于DHL琼脂平板或沙门氏菌显色培养基平板上,36℃±1℃培养18h~
24h,观察各个平板上生长的菌落,沙门氏菌在各个平板上的菌落特征见表1。
6.4 生化试验
6.4.1 从选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于
底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36℃±1℃培养
18h~24h,必要时可延长至48h。三糖铁琼脂培养基特征变化见表2。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶
试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表3。
6.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、
尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接
种。于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h。将已挑菌落的平板储存于2℃~5℃或室
温至少保留24h,以备必要时复查。
6.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据6.4.1的初步判断结果,从营养琼
脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生
化鉴定系统进行鉴定。
6.5 血清学鉴定
6.5.1 检查培养物有无自凝性
采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的玻片
上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻摇动
30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自凝性,
反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。
6.5.2 O抗原的鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,
在其中一个区域下部加1滴多价菌体O血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用无
菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1min,并对着暗背景进
行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(2%~
3%)细菌培养基上再检查;如果因Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应,可挑取菌苔于1mL生理盐水
中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
6.5.3 H抗原的鉴定
操作同6.5.2。H 抗原......
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