| 标准编号 | GB/T 19567.3-2025 (GB/T19567.3-2025) | | 中文名称 | 苏云金杆菌可湿性粉剂 | | 英文名称 | Bacillus thuringiensis wettable powder | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | G25 | | 国际标准分类 | 65.100.10 | | 字数估计 | 22,242 | | 发布日期 | 2025-10-31 | | 实施日期 | 2026-05-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 19567.3-2004 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、国家标准化管理委员会 | GB/T 19567.3-2025: 苏云金杆菌可湿性粉剂
ICS 65.100.10
CCSG25
中华人民共和国国家标准
代替GB/T 19567.3-2004
苏云金杆菌可湿性粉剂
2025-10-31发布
2026-05-01实施
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局
国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布
前言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定
起草。
本文件代替 GB/T 19567.3-2004《苏云金芽孢杆菌可湿性粉剂》,与 GB/T 19567.3-2004相
比,除结构调整和编辑性改动外,主要技术变化如下:
---增加了苏云金杆菌可湿性粉剂的持久起泡性指标及其试验方法(见4.2、5.12);
---增加了苏云金杆菌可湿性粉剂低温稳定性指标及其试验方法(见4.2、5.13);
---增加了苏云金杆菌可湿性粉剂热储稳定性指标及其试验方法(见4.2、5.14);
---更改了苏云金杆菌可湿性粉剂毒力效价测定用试验虫的说明(见4.2,2004年版的3.2);
---更改了苏云金杆菌可湿性粉剂的pH值指标(见4.2,2004年版的3.2);
---更改了苏云金杆菌可湿性粉剂的润湿时间指标(见4.2,2004年版的3.2);
---增加了检验规则(见第6章);
---更改了苏云金杆菌可湿性粉剂的质量保证期的规定(见7.2,2004年版的6.5);
---更改了苏云金杆菌可湿性粉剂的毒力效价测定的仲裁法(见附录C,2004年版的附录B)。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由中华人民共和国农业农村部提出。
本文件由全国农药标准化技术委员会(SAC/TC133)归口。
本文件起草单位:农业农村部农药检定所、武汉科诺生物科技股份有限公司、江苏东宝农化股份有
限公司、济南天邦化工有限公司、山西绿海农药科技有限公司、福建绿安生物农药有限公司、湖北省生物
农药工程研究中心、沈阳沈化院测试技术有限公司。
本文件主要起草人:廖先骏、刘莹、陈雅洁、吴进龙、王文卓、杨闻翰、金海燕、史晓利、丁绍武、王改霞、
钟刘伟、王月莹。
本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为:
---2004年首次发布;
---本次为第一次修订。
苏云金杆菌可湿性粉剂
1 范围
本文件规定了苏云金杆菌可湿性粉剂的技术要求、检验规则、验收和质量保证期以及标志、标签、包
装、储运,描述了苏云金杆菌可湿性粉剂的试验方法。
本文件适用于苏云金杆菌鲇泽亚种(B.t.a)和苏云金杆菌库斯塔克亚种(B.t.k)可湿性粉剂产品的
质量控制。
注:苏云金杆菌的其他名称、分类地位和形态学特征等描述见附录A。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文
件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于
本文件。
GB/T 1600-2021 农药水分测定方法
GB/T 1601 农药pH值的测定方法
GB/T 1604 商品农药验收规则
GB/T 1605-2001 商品农药采样方法
GB 3796 农药包装通则
GB/T 5451 农药可湿性粉剂润湿性测定方法
GB/T 8170-2008 数值修约规则与极限数值的表示和判定
GB/T 14825-2023 农药悬浮率测定方法
GB/T 16150-1995 农药粉剂、可湿性粉剂细度测定方法
GB/T 19136-2021 农药热储稳定性测定方法
GB/T 28137 农药持久起泡性测定方法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
毒素蛋白 toxinprotein
在芽孢形成时期产生的一种具有杀虫活性的伴孢晶体蛋白。
3.2
毒力效价 toxicitypotency
微生物对靶标有害生物的致死或抑制能力差异的生物学指标。
4 技术要求
4.1 外观
均匀的疏松粉末,不应有团块。
4.2 技术指标
苏云金杆菌可湿性粉剂应符合表1要求。
表1 苏云金杆菌可湿性粉剂技术指标
项目
指标
32000IU/mg规格 16000IU/mg规格
毒素蛋白质量分数/% ≥4.0 ≥2.0
毒力效价a/(IU/mg) ≥32000 ≥16000
pH值 4.0~7.5
水分/% ≤4.0
湿筛试验(通过75μm试验筛)/% ≥98
悬浮率/% ≥70
润湿时间/s ≤120
持久起泡性(1min后泡沫量)/mL ≤60
低温稳定性 冷储后,毒素蛋白质量分数、毒力效价仍应符合本文件的要求
热储稳定性b
热储后,pH值、湿筛试验、润湿时间仍应符合本文件要求,热储前后
质量变化率应不大于1.0%
效价(P.x.)和毒力效价(S.e.)。
5 试验方法
警告:使用本文件的人员应有实验室工作的实践经验。本文件并未指出所有的安全问题。使用者
有责任采取适当的安全和健康措施。
5.1 一般规定
本文件所用试剂和水在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和蒸馏水。
5.2 取样
按 GB/T 1605-2001中5.3.3进行。用随机数表法确定取样的包装件;最终取样量应不少于
200g。
5.3 鉴别试验
5.3.1 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)
本鉴别试验可与毒素蛋白质量分数的测定同时进行。在相同的操作条件下,试样溶液与标样溶液
应具有相同的蛋白区带,由此证明产品中的毒素蛋白的相对分子质量为130000。
5.3.2 生物测定法
采用形态学特征观察和分子生物学鉴定相结合的方式进行。
有效成分的特征见附录A。
5.4 外观
采用目测法测定。
5.5 毒素蛋白质量分数
5.5.1 方法提要
用碱性溶液处理苏云金杆菌可湿性粉剂伴孢晶体,使其降解为毒素蛋白,然后通过SDS-PAGE,依
据蛋白质相对分子质量的差异,使毒素蛋白与其他杂蛋白分离,之后用电泳凝胶成像系统扫描蛋白区带
面积,进行定量。
5.5.2 试剂和溶液
5.5.2.1 水。
5.5.2.2 标准硬水。
5.5.2.3 十二烷基硫酸钠。
5.5.2.4 三羟基甲基氨基甲烷。
5.5.2.5 浓盐酸。
5.5.2.6 氢氧化钠。
5.5.2.7 甘氨酸。
5.5.2.8 甘油。
5.5.2.9 巯基乙醇。
5.5.2.10 溴酚蓝。
5.5.2.11 考马斯亮蓝R-250。
5.5.2.12 甲醇。
5.5.2.13 冰乙酸。
5.5.2.14 无水乙醇。
5.5.2.15 0.55mol/L氢氧化钠溶液:在烧杯中量取100mL水,缓慢加入2.2g氢氧化钠,边加入边搅
拌溶解,待充分溶解后,放置室温,密闭保存备用。
5.5.2.16 1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷12.1g溶于水
中,用浓盐酸调至pH6.8,用水定容至100mL。
5.5.2.17 电泳缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷3.0g,甘氨酸14.4g,十二烷基硫酸钠1g,用水溶解并
定容至1000mL。
5.5.2.18 3×样品稀释液:1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液18.75mL,十二烷基硫酸
钠6g,甘油30mL,巯基乙醇15mL,溴酚蓝0.5g,用水定容至100mL。
5.5.2.19 染色液:称取考马斯亮蓝R-2501.0g,加入甲醇450mL,冰乙酸100mL,水450mL,溶解过
滤后使用。
5.5.2.20 脱色液:量取甲醇100mL,冰乙酸35mL,用水定容至1000mL。
5.5.2.21 漂洗液:量取无水乙醇30mL,冰乙酸10mL,水60mL,混合均匀后使用。
5.5.2.22 固定液:量取冰乙酸75mL,用水定容至1000mL,混合均匀后使用。
5.5.2.23 毒素蛋白(相对分子质量为130000)标样且已知质量分数不低于9.0%。
5.5.3 仪器
5.5.3.1 电泳仪。
5.5.3.2 夹芯式垂直电泳槽(1.0mm凹形带槽橡胶模框)、凝胶板(1.0mm,15孔或10孔样品槽模具)。
5.5.3.3 电泳凝胶成像系统。
5.5.3.4 水浴锅。
5.5.3.5 可调移液器。
5.5.3.6 微量进样器。
5.5.3.7 离心机:20000r/min。
5.5.3.8 脱色摇床:90r/min。
5.5.4 测定步骤
5.5.4.1 试样处理
分别称取含5.5mg(精确至0.mg)毒素蛋白的标样和试样,置于10mL离心管中,准确加入5mL
水,充分混匀,移取0.5mL至1.5mL离心管中,加入0.55mol/L氢氧化钠溶液0.125mL(使氢氧化钠
溶液的最终浓度为0.1mol/L),摇匀,静置5min,再加入3×样品稀释液0.325mL,于沸水浴中煮
6min,冷却至室温,15000r/min离心5min,取上层清液,以备电泳上样,样品的折算的最终定容体积
为9.5mL。
5.5.4.2 SDS-PAGE分离毒素蛋白
5.5.4.2.1 制备8%~10%聚丙烯酰胺凝胶
采用不连续缓冲系统,制胶方法见附录B。
5.5.4.2.2 上样
取上述标样溶解液上层清液,于聚丙烯酰胺凝胶的上样孔中分别上样2μL、4μL、6μL、8μL、
10μL(毒素蛋白质量约为1μg~5μg),取6μL的试样溶液上层清液(毒素蛋白含量约为3μg)加入上
样孔中,注入电泳缓冲液后,接通电源。
5.5.4.2.3 电泳
电泳初期电压控制在100V左右,待试样进入分离胶后,加大电压到120V,继续电泳,当指示剂前
沿到达距底端1cm左右时停止电泳,取出胶板,在固定液中浸泡30min。
5.5.4.2.4 染色
将分离胶部分取下,用染色液染色过夜。
5.5.4.2.5 脱色
倒去染色液,先用漂洗液洗涤凝胶,然后加入脱色液使其脱色,根据需要更换几次脱色液,直至背景
清晰为止。
5.5.4.3 测定
凝胶经脱色后,能清晰地看到130000蛋白区带,用电泳凝胶成像系统及相关的图形处理软件处理
该区带,得到各蛋白区带的灰度值,对于标样溶液作毒素蛋白质量对蛋白区带灰度值的标准曲线;利用
样品溶液的区带灰度值,由标准曲线计算其对应的毒素蛋白质量。
5.5.5 计算
试样中毒素蛋白的质量分数按公式(1)计算:
w1=
m1×V1
m2×V2×
100 (1)
式中:
w1 ---试样中毒素蛋白的质量分数,%;
m1 ---从标准曲线上查得的试样中毒素蛋白的数值,单位为微克(μg);
V1 ---试样最终定容体积的数值,单位为毫升(mL);
m2 ---试样的质量的数值,单位为毫克(mg);
V2 ---注入凝胶上样孔的试样体积的数值,单位为微升(μL)。
5.5.6 允许差
毒素蛋白质量分数两次平行测定结果之相对差应不大于8%,取其算术平均值作为测定结果。
5.6 毒力效价
按附录C进行。
5.7 pH值
按 GB/T 1601进行。
5.8 水分
按 GB/T 1600-2021中4.3进行。
5.9 湿筛试验
按 GB/T 16150-1995中2.2进行。
5.10 悬浮率
5.10.1 测定
按GB/T 14825-2023中4.2进行。称取500mg(精确至0.1mg)试样,置于200mL烧杯中,加入
50mL标准硬水,以120r/min速度搅拌2min,混合均匀试样。将悬浮液全部转移至250mL具塞玻
璃量筒中,用标准硬水稀释到250mL。经过处理之后,将量筒内剩余的25mL悬浮液及沉淀物全部转
移至100mL烧杯,充分混匀,移取0.5mL至1.5mL离心管中,加入0.55mol/L氢氧化钠溶液
0.125mL(使氢氧化钠溶液的最终浓度为0.1mol/L),摇匀,静置5min,再加入3×样品稀释液
0.325mL,于沸水浴中煮6min,冷却至室温,15000r/min离心5min,取上层清液,以备电泳上样,量
筒底部25mL悬浮液折算的最终定容体积为47.5mL。取10μL的试样离心上层清液加入到上样孔
中,按5.5.4.2测定毒素蛋白质量分数。
5.10.2 计算
悬浮率按公式(2)计算:
w2=
m4×w1-m3×V3×100÷V4
m4×w1 ×
111.1 (2)
式中:
w2 ---悬浮率,%;
m4 ---试样的质量,单位为毫克(mg);
w1 ---试样中毒素蛋白的质量分数,%;
m3 ---从标准曲线上查得的试样中毒素蛋白的量的数值,单位为微克(μg);
V3 ---量筒底部25mL悬浮液最终定容体积,单位为毫升(mL);
100 ---单位换算系数;
V4 ---注入凝胶上样孔的样品体积,单位为微升(μL);
111.1---测定体积与总体积的换算系数。
5.11 润湿时间
按 GB/T 5451进行。
5.12 持久起泡性
按 GB/T 28137进行。
5.13 低温稳定性
5.13.1 方法提要
将试样于(0±2)℃储存7d后,对规定项目进行测定。
5.13.2 仪器
5.13.2.1 制冷器:(0±2)℃。
5.13.2.2 干燥器。
5.13.3 试验步骤
将5g试剂置于玻璃瓶中封闭,在(0±2)℃的制冷器中储存7d,取出,放入干燥器中,恢复至室
温,于24h内进行测定。
5.14 热储稳定性
按 GB/T 19136-2021中4.4.1进行。
6 检验规则
6.1 出厂检验
每批产品均应做出厂检验,经检验合格签发合格证后,方可出厂。出厂检验项目为第4章中的全部
项目。
6.2 型式检验
型式检验项目为第4章中的全部项目,在正常连续生产情况下,每3个月至少进行一次。有下述情
况之一,应进行型式检验:
a) 原料有较大改变,可能影响产品质量时;
b) 生产地址、生产设备或生产工艺有较大改变,可能影响产品质量时;
c) 停产后又恢复生产时;
d) 国家质量监管机构提出型式检验要求时。
6.3 判定规则
按 GB/T 8170-2008中4.3.3判定检验结果是否符合本文件要求。
出厂检验和型式检验中,任一项目不符合第4章的技术要求,则判为该批次产品不合格。
7 验收和质量保证期
7.1 验收
应符合 GB/T 1604的规定。
7.2 质量保证期
在8.2的储运条件下,质量保证期内的毒素蛋白质量分数应不低于出厂检验值的70%,且各项指标
均应符合本文件要求。苏云金杆菌可湿性粉剂的质量保证期从生产日期算起为2年。
8 标志、标签、包装、储运
8.1 标志、标签、包装
苏云金杆菌可湿性粉剂的标志、标签、包装应符合 GB 3796的规定;苏云金杆菌可湿性粉剂的包装
采用清洁、干燥的复合膜袋或铝箔袋包装,每袋净含量可以为50g、100g、200g、500g等。
8.2 储运
苏云金杆菌湿性粉剂包装件应储存在通风、阴凉、干燥的库房中,严防日晒;储运时,产品对温度敏
感,应关注储运时的温度变化,应严防潮湿、日晒和高温,不应与食物、种子、饲料混放,避免与皮肤、眼睛
接触,防止由口鼻吸入。
附 录 A
(资料性)
苏云金杆菌的其他名称、分类地位和形态学特征等描述
苏云金杆菌的其他名称、分类地位和形态学特征等描述如下。
---中文通用名称:苏云金杆菌+菌株编号。
---分类地位:细菌(Bacteria);厚壁菌门(Firmicutes);芽孢杆菌纲(Bacilli);芽孢杆菌目(Bacil-
lales);芽孢杆菌科(Bacillaceae);芽孢杆菌属(Bacillus)。
---形态学特征:菌体在显微镜下呈椭圆形杆状,呈短链或者长链状排列,大小为(1.2~1.8)μm×
(3.0~5.0)μm,革兰氏染色阳性。芽孢为椭圆形,靠近中间生长,大小为2μm×(0.8~0.9)μm,芽
孢囊微膨大。菌体的一端或两端会释放不定量的伴孢晶体(parasporalcrystal),多数为长菱
形、短菱形、方形,也有呈不规则形、三角形及镶嵌形等。在营养琼脂(NA)上菌落为圆形或者
椭圆形,淡黄色,边缘不规则,不透明微隆起呈滴蜡状。
---有效成分主要存在形式:伴孢晶体。
---主要生物活性:杀虫(防病)。
---培养保存条件:最适生长温度为30℃~37℃;适合培养基为营养琼脂(NA)或营养肉汤(NB)
培养基;适宜储存温度为0℃~4℃。
附 录 B
(资料性)
电泳凝胶的制备
B.1 制板
选择两块大小一样的玻璃板,其中一块一端带有2cm~3cm高的凹槽。两块玻璃板洗净干燥
后,固定在制板装置上,下端密封完整,形成1.0mm间隙的制胶板。
B.2 试剂与溶液
B.2.1 水。
B.2.2 十二烷基硫酸钠。
B.2.3 四甲基乙二胺。
B.2.4 丙烯酰胺。
B.2.5 亚甲基双丙烯酰胺(又称:甲叉双丙烯酰胺)。
B.2.6 三羟基甲基氨基甲烷。
B.2.7 浓盐酸。
B.2.8 过硫酸铵。
B.2.9 甘氨酸。
B.2.10 30%丙烯酰胺溶液:称取丙烯酰胺29.0g,亚甲基双丙烯酰胺1.0g,溶于100mL水中,过
滤,于4℃暗处储存备用。
B.2.11 1mol/L、pH8.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷30.2g溶于水
中,用浓盐酸调至pH8.8,用水定容至250mL。
B.2.12 1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷12.1g溶于水
中,用浓盐酸调至pH6.8,用水定容至100mL。
B.2.13 10%十二烷基硫酸钠溶液:称取十二烷基硫酸钠0.5g,用水溶解并定容至5mL。
B.2.14 10%过硫酸铵溶液:称取过硫酸铵0.1g,用水溶解并定容至1mL,于4℃储存备用,储存期不
超过一周。
B.2.15 电泳缓冲液:称取三羟基甲基氨基甲烷3.0g,甘氨酸14.4g,十二烷基硫酸钠1g,用水溶解并
定容至1000mL。
B.3 制备分离胶
从冰箱中取出制胶试剂,平衡至室温。按表B.1先配制分离胶。将胶液配好、混匀后,迅速注入两
块玻璃板的间隙中,至胶液面离玻璃板凹槽3.5cm左右。然后在胶面上轻轻铺高度1cm高的水,加水
时通常顺玻璃板慢慢加入,勿扰乱胶面。垂直放置胶板于室温约30min左右使之凝聚。此时,在凝胶
和水之间可以看到很清晰的一条界面。然后倒出胶面上的水。
表B.1 SDS-PAGE凝胶的配方
储备液 10%分离胶 8%分离胶 5%浓缩胶
30%丙烯酰胺溶液 6.7mL 5.3mL 1.3mL
1mol/L、pH8.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 7.6mL 7.6mL -
1mol/L、pH6.8三羟基甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液 - - 1.0mL
水 5.3mL 6.7mL 5.5mL
10%十二烷基硫酸钠 0.2mL 0.2mL 80μL
10%过硫酸铵 0.2mL 0.2mL 80μL
四甲基乙二胺 8μL 12μL 8μL
总体积 20mL 20mL 8mL
B.4 制备浓缩胶
按表B.1配制浓缩胶,用少量灌入玻璃板间隙中,冲洗分离胶胶面,而后倒出。然后把余下的胶液
注入玻璃板间隙,使胶液面与玻璃板凹槽处平齐,而后插入“梳子”,在室温放置30min,浓缩胶即可凝
固。慢慢取出梳子,取时应防止把胶孔弄破。取出梳子后,在形成的胶孔中加入水,冲洗杂质,倒出孔中
水,再加入电泳缓冲液。
将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上,带凹槽的玻璃板与电泳槽紧贴在一起,形成一个储液
槽,向其中加入电泳缓冲液,使其与胶孔中的缓冲液相接触,在电泳槽下端的储液槽中也加入电泳缓
冲液。
附 录 C
(规范性)
毒力效价的测定
C.1.1 试剂和材料
C.1.1.1 标准品:已知毒力效价标准品。
C.1.1.2 棉铃虫幼虫:Helicoverpaarmigera。
C.1.1.5 冰乙酸。
C.1.1.6 水。
C.1.1.7 36%乙酸溶液:体积比φ(乙酸∶水)=36∶64。
C.1.1.8 苯甲酸钠。
C.1.1.9 维生素C。
C.1.1.10 琼脂粉。
C.1.1.11 氯化钠。
C.1.1.12 磷酸氢二钾。
C.1.1.13 磷酸二氢钾。
C.1.1.14 聚山梨酯-80。
C.1.1.15 磷酸缓冲液:分别称取氯化钠8.5g,磷酸氢二钾6.0g,磷酸二氢钾3.0g于玻璃器皿中,加入
0.1mL聚山梨酯-80和1000mL水,充分溶解后混匀。
C.1.2 仪器和设备
C.1.2.1 电动搅拌器:无级调速,100r/min~6000r/min。
C.1.2.2 微波炉或电炉。
C.1.2.3 振荡器。
C.1.2.4 水浴锅。
C.1.2.5 组织培养盘:24孔。
C.1.2.6 搪瓷盘:30cm×20cm。
C.1.2.7 磨口三角瓶:250mL,具塞。
C.1.2.8 大烧杯:1000mL。
C.1.2.9 小烧杯:50mL。
C.1.2.10 试管:18mm×180mm。
C.1.2.11 玻璃珠:直径5mm。
C.1.2.12 注射器:50mL。
C.1.2.13 移液管。
C.1.2.14 标本缸。
C.1.2.15 恒温培养箱。
C.1.3 测定步骤
C.1.3.1 感染液的配制
C.1.3.1.1 标准品
称取100.0mg~150.0mg(精确到0.1mg)标准品,装入250mL装有10粒玻璃珠的磨口三角瓶
中。加入100mL磷酸缓冲液,浸泡10min,在振荡器上振荡30min。得到浓度约为1mg/mL的标准
品母液(该母液在4℃冰箱中可存放10d)。然后将标准品母液用磷酸缓冲液以一定的倍数等比稀
释,稀释成浓度约为1.000mg/mL、0.500mg/mL、0.250mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、
0.0313mg/mL6个稀释感染液,并设磷酸缓冲液作对照,每一浓度感染液吸取3mL~50mL至小烧
杯内待用,对照吸取3mL磷酸缓冲液。
C.1.3.1.2 样品
称取相当于标准品毒力效价的可湿性粉剂样品适量(精确到0.1mg),加100mL磷酸缓冲液,然后
按照C.1.3.1.1标准品的配制方法配制样品感染液。
对有些效价过高或过低的样品,在测定前应先以3个距离相差较大的浓度做预备试验,估计LC50
值的范围,据此设计稀释浓度。
C.1.3.2 感染饲料的配制
C.1.3.2.1 饲料配方
酵母粉12g、黄豆粉24g、维生素C1.5g、苯甲酸钠0.42g、36%乙酸3.9mL、水300mL。
C.1.3.2.2 饲料配制
将黄豆粉、酵母粉、维生素C、苯甲酸钠和36%乙酸放入大烧杯内,加100mL水湿润,另将余下
200mL水加入4.5g琼脂粉,在微波炉或电炉上加热至沸腾,使琼脂完全熔化,取出冷却至70℃,即与
其他成分混合,在电动搅拌器内高速搅拌1min,迅速移至60℃水浴锅中加盖保温。
用注射器吸取27mL饲料,注入上述已有样品或标准品感染液的烧杯内,以电动搅拌器高速搅拌
0.5min,迅速倒入组织培养盘上各小孔中(倒入量不必一致,以铺满孔底为准),凝固待用。
C.1.3.3 接虫感染
于26℃~30℃室温下,将未经取食的初孵幼虫(孵化后12h内)抖入直径20cm的标本缸中,静待
数分钟选取爬上缸口的健康幼虫作供试虫,用毛笔轻轻地将它们移入已有感染饲料的组织盘的小孔
内,每孔一头虫。每个浓度和空白对照皆放48头虫,用塑料薄片盖住,然后将组织培养盘逐个叠起,用
橡皮筋捆紧,竖立放于30℃恒温培养箱内培养72h。
C.1.4 结果检查及计算
用肉眼或放大镜检查死、活虫数。以细签触动虫体,完全无反应的为死虫,计算死亡率。如对照有
死亡,可查Abbott校正值表或按公式(C.1)计算校正死亡率。对照死亡率在5%以下不用校正,5%~
10%之间需校正,大于10%则测定无效。
X1=
T-C
1-C ×
100 (C.1)
式中:
X1---校正死亡率,%;
T ---处理死亡率,%;
C ---对照死亡率,%。
将浓度换算成对数值,死亡率或校正死亡率换算成机率值,用最小二乘法工具分别求出标准品和样
品的LC50值,按公式(C.2)计算试样的毒力效价。
X2=
S×P
(C.2)
式中:
X2---试样的毒力效价,单位为国际单位每毫克(IU/mg);
S ---标准品LC50值;
P ---标准品效价,单位为国际单位每毫克(IU/mg);
Y ---样品LC50值。
C.1.5 允许差
毒力测定法测定允许相对差,但每个样品3次重复测定结果之最大相对差不应超过20%。毒力测
定制剂各浓度所引起的死亡率应在10%~90%之间,在50%死亡率上下至少应各有两个浓度。
C.2.1 试剂和材料
C.2.1.1 标准品:已知毒力效价标准品。
C.2.1.2 小菜蛾幼虫:Plutellaxylostella。
C.2.1.5 维生素C。
C.2.1.6 琼脂粉:凝胶强度大于300g/cm2。
C.2.1.7 磷酸氢二钾。
C.2.1.8 磷酸二氢钾。
C.2.1.9 聚山梨酯-80。
C.2.1.10 菜叶粉:甘蓝型油菜叶,80℃烘干,磨碎,过80目筛。
C.2.1.11 蔗糖。
C.2.1.12 纤维素粉CF-11。
C.2.1.13 氢氧化钾。
C.2.1.14 氢氧化钾水溶液:c氢氧化钾=0.001mol/L。
C.2.1.15 氯化钠。
C.2.1.16 对羟基苯甲酸甲酯。
C.2.1.17 95%乙醇。
C.2.1.18 尼泊金溶液:称取15g对羟基苯甲酸甲酯,加入100mL95%乙醇,充分溶解后混匀。
C.2.1.19 甲醛。
C.2.1.20 水。
C.2.1.21 甲醛水溶液:体积比φ(甲醛∶水)=10∶90。
C.2.1.22 干酪素:生物试剂。
C.2.1.23 干酪素溶液:称取2g干酪素,加2mL氢氧化钾水溶液溶解,再加入8mL水,混合均匀。
C.2.1.24 磷酸缓冲液:同C.1.1.15。
C.2.2 仪器和设备
C.2.2.1 磨口三角瓶:250mL。
C.2.2.2 电动搅拌器:无级调速,100r/min~6000r/min。
C.2.2.3 医用手术刀。
C.2.2.4 振荡器。
C.2.2.5 水浴锅。
C.2.2.6 养虫管:9cm ×2.5cm。
C.2.2.7 烧杯:50mL、500mL。
C.2.2.8 试管:18mm×180mm。
C.2.2.9 玻璃珠:直径5mm。
C.2.2.10 移液管。
C.2.3 测定步骤
C.2.3.1 感染液的配制
C.2.3.1.1 标准品
称取100.0mg~150.0mg(精确到0.1mg)标准品,装入250mL装有10粒玻璃珠的磨口三角瓶
中。加入100mL磷酸缓冲液,浸泡10min,在振荡器上振荡30min。得到浓度约为1mg/mL的标准
品母液(该母液在4℃冰箱中可存放10d)。然后将标准品母液稀释成浓度约为1.000mg/mL、
0.500mg/mL、0.250mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL、0.0313mg/mL6个稀释感染液。
C.2.3.1.2 样品
称取相当于标准品毒力效价的可湿性粉剂样品适量(精确到0.1mg),加100mL磷酸缓冲液,然后
参照标准品的配制方法配制样品感染液。
C.2.3.2 感染饲料的配制
C.2.3.2.1 饲料配方
维生素C0.5g、干酪素溶液1.0mL、菜叶粉3.0g、酵母粉1.5g、纤维素粉CF-111.0g、琼脂粉
2.0g、蔗糖6.0g、菜籽油0.2mL、甲醛溶液0.5mL、尼泊金溶液1.0mL、水100mL。
C.2.3.2.2 饲料配制
将蔗糖、酵母粉、干酪素溶液、琼脂粉加入90mL的水中调匀。搅拌煮沸,使琼脂完全熔化,加入尼
泊金,搅匀。将其他成分用剩余的10mL水调成糊状。当琼脂冷却至75℃左右时与之充分混合,搅
匀,置55℃水浴锅中保温备用。取50mL烧杯7只,写好标签,置55℃水浴中预热,分别向每个烧杯
中加入1mL对应浓度的感染液,缓冲液作空白对照。向每个烧杯中加入9mL熔化的饲料;用电动搅
拌器搅拌20s,使每个烧杯中的感染液与饲料充分混匀。
将烧杯静置,待冷却凝固后,用医用手术刀将感染饲料切成1cm×1cm的饲料块,每个浓度取4个
饲料块分别放入4支养虫管中,每管放入1块,写好标签。
C.2.3.3 接虫感染
随机取已放置饲料的养虫管,每管投入10头小菜蛾三龄初幼虫,每浓度4管,塞上棉塞,写好标
签,在相同饲养条件下饲养。
C.2.4 结果检查及计算
感染48h后检查试虫的死亡情况。判断死虫的标准是以细签轻轻触动虫体,无任何反应者判为
死亡。
计算标准品和样品各浓度的供测昆虫死亡率,查Abbott表或用公式(C.1)计算校正死亡率,对照死
亡率在5%以下不用校正,5%~10%之间需校正,大于10%则测定无效。
将感染液各浓度换算成对数值,校正死亡率转换成死亡机率值,用最小二乘法工具分别求出标准品
LC50值和待测样品LC50值,然后按公式(C.2)计算待测样品的毒力效价。
C.2.5 允许差
毒力测定方法的允许相对差要求与C.1.5相同。
C.3 毒力效价测定方法---用甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)作试虫的测定方法
C.3.1 试剂和材料
C.3.1.1 标准品:已知毒力效价标准品。
C.3.1.2 甜菜夜蛾幼虫:Spodopteraexigua。
C.3.1.5 维生素C。
C.3.1.6 15%尼泊金:对羟基苯甲酸甲酯溶于95%乙醇。
C.3.1.7 10%甲醛:甲醛溶于水。
C.3.1.8 对羟基苯甲酸甲酯。
C.3.1.9 95%乙醇。
C.3.1.10 尼泊金溶液:称取15g对羟基苯甲酸甲酯,加入100mL95%乙醇,充分溶解后混匀。
C.3.1.11 甲醛。
C.3.1.12 水。
C.3.1.13 甲醛水溶液:体积比φ(甲醛∶水)=1∶9。
C.3.1.14 琼脂粉:凝胶强度大于300g/cm2。
C.3.1.15 磷酸缓冲液:同C.1.1.15。
C.3.2 仪器和设备
C.3.2.1 电动搅拌器:无级调速,100r/min~6000r/min。
C.3.2.2 微波炉或电炉。
C.3.2.3 振荡器。
C.3.2.4 水浴锅。
C.3.2.5 组织培养盘:24孔。
C.3.2.6 搪瓷盘:30cm×20cm。
C.3.2.7 磨口三角瓶:250mL,具塞。
C.3.2.8 大烧杯:1000mL。
C.3.2.9 小烧杯:50mL。
C.3.2.10 试管:18mm×180mm。
C.3.2.11 玻璃珠:直径5mm。
C.3.2.12 注射器:50mL。
C.3.2.13 标本缸。
C.3.2.14 恒温培养箱。
C.3.3 测定步骤
C.3.3.1 感染液的配制
C.3.3.1.1 标准品
称取100.0mg~150.0mg(精确到0.1mg)标准品,装入250mL装有10粒玻璃珠的磨口三角瓶
中。加入100mL磷酸缓冲液,浸泡10min,在振荡器上振荡30min。得到浓度约为1mg/mL的标准
品母液(该母液在4℃冰箱中可存放10d)。然后将标准品母液用磷酸缓冲液以一定的倍数......
|