| 标准编号 | GB/T 38502-2020 (GB/T38502-2020) | | 中文名称 | 消毒剂实验室杀菌效果检验方法 | | 英文名称 | Test method for bactericidal effect of disinfectant in laboratory | | 行业 | 国家标准 (推荐) | | 中标分类 | C50 | | 国际标准分类 | 11.080 | | 字数估计 | 26,226 | | 发布日期 | 2020-03-06 | | 实施日期 | 2020-10-01 | | 发布机构 | 国家市场监督管理总局、中国国家标准化管理委员会 | GB/T 38502-2020: 消毒剂实验室杀菌效果检验方法
GB/T 38502-2020 英文名称: Test method for bactericidal effect of disinfectant in laboratory
1 范围
本标准规定了消毒剂实验室杀菌效果检验的术语和定义、基本要求以及消毒与灭菌效果试验方法。
本标准适用于各种消毒剂实验室杀菌效果的检验和评价。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489 实验室 生物安全通用要求
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
消毒剂
用于杀灭传播媒介上的微生物使其达到消毒或灭菌要求的制剂。
3.2
中和剂
在微生物杀灭试验中, 以消除试验微生物与消毒剂的混悬液中和微生物表面上残留的消毒剂,使
其失去对微生物抑制和杀灭作用的试剂。
3.3
中和产物
中和剂与消毒剂作用后的产物。
3.4
菌落形成单位
在活菌培养计数时,由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落,以
其表达活菌的数量。
3.5
杀灭对数值
消毒前后微生物减少的对数值。
3.6
载体
试验生物的支持物。
4 基本要求
4.1 实验室及人员要求
实验室及人员要求见附录A。
4.2 消毒试验要求
4.2.1 检测要求
检测要求包括以下几点:
a) 实验室试验以悬液定量试验为主,试验应重复3次。对不适宜用悬液定量试验评价的消毒剂,
如黏稠的消毒剂、冲洗用消毒剂和原液使用的消毒剂等的实验室试验可用载体定量试验,试验
应重复3次。无特殊要求的情况下,载体定量试验以布片为载体,用途单一、明确的可以选用
对应的玻璃片、不锈钢片、滤纸片等。
b) 评价消毒剂的实验室试验,消毒剂试验浓度应用产品说明书规定的该消毒剂对某一有代表性
消毒对象的最低使用浓度。试验设3个不同作用时间,原则上第一时间为说明书规定的最短
作用时间的0.5倍,第二时间为最短作用时间,第三时间为最短作用时间的1.5倍。
c) 对多用途的消毒剂,消毒对象所涉及的微生物相同时,若使用浓度相同,选择各种用途中最短
的作用时间。若作用时间相同,选择各种用途中最低的使用浓度。使用浓度低、作用时间短者
与使用浓度高、作用时间长者同时存在时,以前者为准。使用浓度高、作用时间短者与使用浓
度低,作用时间长者同时存在时,每个剂量均应进行试验。
d) 灭菌试验应用载体定性试验,普通医疗器械的灭菌以不锈钢片为载体,特殊用途的可以选用玻
璃片、聚四氟乙烯片等。灭菌试验按产品说明书规定的最低使用浓度(强度)和0.5倍的最短
作用时间进行试验。载体定性试验应重复5次,样本总量应不少于30个,每次试验均应设立
规定数量的阴性对照和阳性对照。
e) 进行实验室试验时,对用于不经过清洗或较脏的消毒对象的消毒剂,有机干扰物牛血清白蛋白
的浓度为3.0%;对用于经过清洗或较清洁的消毒对象的消毒剂,有机干扰物牛血清白蛋白的
浓度为0.3%;对用于经过严格清洗或极清洁的消毒对象的消毒剂,可不使用有机干扰物。
4.2.2 重复试验的要求
重复性试验不是只在同次试验中增加菌片数,或多作几份样本,而是应分期分批进行。必要的器材
和试剂应重新制备或灭菌,以防产生系统性误差。
4.2.3 结果评价
符合下列所有相应条件的消毒产品判为消毒效果试验结果合格:
a) 去除残留消毒剂效果的鉴定试验合格。
b) 消毒产品的实验室试验结果符合下列指标要求:
1) 悬液定量杀菌试验时,每次试验对细菌繁殖体和细菌芽胞如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、
铜绿假单胞菌和枯草杆菌黑色变种芽胞的杀灭对数值大于或等于5.00,对龟分枝杆菌脓
肿亚种、白色念珠菌和黑曲霉菌的杀灭对数值大于或等于4.00。对照组微生物数在规定
的范围内。
2) 载体浸泡定量杀菌试验时,每次试验对各类微生物的杀灭对数值或灭活对数值大于或等
于3.00,对照组微生物数在规定的范围内。载体浸泡定性灭菌试验时,各次试验所有载体
均无试验菌生长,对照组微生物数在规定的范围内。
5 消毒与灭菌效果试验方法
5.1 细菌悬液与菌片的制备
5.1.1 实验器材
5.1.1.1 实验菌种
金黄色葡萄球菌ATCC6538、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠杆菌8099、枯草杆菌黑色变种芽胞
ATCC9372、白色葡萄球菌8032。在上述规定的菌株基础上,根据消毒剂特定用途或试验特殊需要,还
可增选其他菌株。
5.1.1.2 实验试剂
有机干扰物、磷酸盐缓冲液、无菌蒸馏水或其他纯化水、稀释液、细菌培养基、营养琼脂培养基、营养
肉汤培养基、革兰染色液、芽胞染色液(见附录B)。
5.1.1.3 实验设备与耗材
恒温水浴箱、离心机、电动混匀器、浊度计、恒温培养箱、玻璃漏斗、刻度吸管(1.0mL、5.0mL、
10.0mL)、毛细吸管、移液器(10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL)及配套的塑料吸头。
5.1.2 细菌悬液制备程序
5.1.2.1 细菌繁殖体悬液的制备
5.1.2.1.1 以无菌操作方式开启菌种管,用毛细吸管加入适量营养肉汤培养基,吹吸数次,使菌种融化
分散。取含5.0mL~10.0mL营养肉汤培养基试管,滴入少许菌种悬液,置36℃±1℃培养18h~24h。
用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,置36℃±1℃培养18h~24h。
或从菌种保存管中取出一粒菌珠接种于平皿上,置36℃±1℃培养18h~24h,挑取上述第2代培养
物中典型菌落,接种于营养琼脂斜面,置36℃±1℃培养18h~24h,即为第3代培养物。
5.1.2.1.2 取第3代~第8代的营养琼脂培养基培养18h~24h的新鲜斜面培养物,用5.0mL吸管吸
取3.0mL~5.0mL稀释液(一般用TPS,酸化水用生理盐水)加入试管内,反复吹吸,洗下菌苔。随后,
用5.0mL吸管将洗液移至另一无菌试管中,用电动混匀器混合20s,或在手掌上振打80次,以使细菌
悬浮均匀。
5.1.2.1.3 初步制成的菌悬液,先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度,然后以稀释液稀释至所需
浓度。
5.1.2.1.4 细菌繁殖体悬液应保存在4℃ 冰箱内备用。应当天使用,不得过夜。
5.1.2.1.5 怀疑有污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。
5.1.2.2 细菌芽胞悬液的制备
5.1.2.2.1 以无菌操作方式开启菌种管,用毛细吸管加入适量营养肉汤培养基,吹吸数次,使菌种融化
分散。取含5.0mL~10.0mL营养肉汤培养基试管,滴入少许菌种悬液,置36℃±1℃培养18h~24h。
用接种环取第1代培养的菌悬液,划线接种于营养琼脂培养基平板上,置36℃±1℃培养18h~24h。
挑取上述第2代培养物中典型菌落,接种于营养肉汤培养基,置36℃±1℃培养18h~24h,即为第3
代培养物。
5.1.2.2.2 用10.0mL吸管吸取5.0mL~10.0mL第3代~第5代的18h~24h营养肉汤培养物,接
种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面,将其摇动使菌液布满营养琼脂培养基的表面,再将多余肉汤培养物
吸出,将罗氏瓶置36℃±1℃恒温培养箱内培养5d~7d。
5.1.2.2.3 用接种环取菌苔少许涂于玻片上,以改良芽胞染色法染色。
改良芽胞染色法步骤如下:
a) 用接种环取菌苔涂布于玻片上,待自然干燥,而后通过火焰加热将菌固定于玻片上。
b) 将涂片放入平皿内,片上放两层滤纸,滴加足量的5.00%孔雀绿水溶液。将平皿盖好,放54℃~
56℃条件下,加热30min。取出,去滤纸,用自来水冲去残留液。
c) 加0.5%沙黄水溶液,染1min。水洗,待干后镜检。芽胞呈绿色,菌体呈红色。并在显微镜
(油镜)下进行镜检。当芽胞形成率达90%以上时,即可进行后续处理。否则,应继续在室温
下放置一定时间,直至达到上述芽胞形成率后再进行以下处理。
5.1.2.2.4 加10.0mL无菌蒸馏水于罗氏瓶中,以L棒轻轻推刮下菌苔,吸出,再加入5.0mL无菌蒸馏
水冲洗培养基表面,吸出。将两次吸出的菌悬液集中于含玻璃珠的无菌锥形烧瓶中,振摇5min。
5.1.2.2.5 将烧瓶置45℃水浴中24h,使菌自溶断链,分散成单个芽胞。
5.1.2.2.6 用无菌棉花或纱布过滤芽胞悬液,清除琼脂凝块。
5.1.2.2.7 将芽胞悬液置无菌离心管内,以3000r/min速度离心30min。弃上清液,加蒸馏水吹吸使
芽胞重新悬浮,本步骤重复3遍。
5.1.2.2.8 将洗净的芽胞悬液放入含适量小玻璃珠的烧瓶内,80℃水浴10min(或60℃水浴30min),
以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后,摇匀分装保存于4℃冰箱中备用。有效使用期半年。
5.1.2.2.9 芽胞悬液在使用时,应先进行活菌培养计数。
5.1.2.2.10 怀疑有杂菌污染时,应以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。
5.1.3 菌片(染菌载体)的制备程序
5.1.3.1 菌片用载体应根据消毒对象选择相应的材料,如手术器械选择不锈钢片,物体表面选择棉布
片,非金属管腔选择聚四氟乙烯片(管),光滑表面可选择玻璃片等。常用的材料有金属、玻璃、滤纸、棉布、聚四氟乙烯等,金属载体一般用12mm直径圆形金属片(厚0.5mm),其他材质载体一般为方形,大
小10mm×10mm,特定用途的消毒产品可使用其他材质、形状的载体。
5.1.3.2 所用载体(除滤纸片外)于染菌前,应进行脱脂处理。脱脂过程应严格按照如下步骤进行:
a) 将载体放在含洗涤剂的水中煮沸30min;
b) 以自来水洗净;
c) 用蒸馏水煮沸10min;
d) 用蒸馏水漂洗至pH呈中性。
5.1.3.3 布片用40织纱的白平纹棉布制作。将脱脂后的布块按载体规定的大小抽去边缘一周的经纬
纱各一根,按抽纱痕剪开。金属片以不锈钢制作,纸片以滤纸制作。
5.1.3.4 载体经压力蒸汽灭菌后,使用滴染法染菌。
染菌用菌悬液:菌悬液和芽胞悬液的制备按5.1.2进行,试验用菌悬液的含菌量约为109CFU/mL,
可使用浊度计调整菌液浓度。然后加入等量3.0%或0.3%的牛血清白蛋白,使菌液的浓度约为5×108
CFU/mL。
滴染法染菌时,将经灭菌的载体片平铺于无菌平皿内,用移液器逐片滴加菌液,必要时用接种环涂
匀整个载体表面。置36℃±1℃恒温培养箱或室温干燥备用。
5.1.3.5 每个菌片(载体)的回收菌量应为1×106CFU/片~5×106CFU/片。
5.1.4 注意事项
5.1.4.1 用浊度计测定的菌悬液浓度,只用于在滴染菌片时对菌悬液稀释度的估计。作为菌悬液含菌
浓度或菌片染菌量的正式报告(如杀菌试验中阳性对照组菌悬液或菌片所含菌量),应以活菌培养计数
的实测结果为准,不宜使用根据比浊法判定的估计值。
5.1.4.2 菌液滴加不宜过快,避免流散影响染菌的准确性。
5.1.4.3 细......
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